灵芝红茶抗氧化活性成分的含量测定研究

刘良琴，龚小见，周欣，*，赵超，陈华国

（1.贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州贵阳550001；2.贵州师范大学贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州贵阳550001；3.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵州贵阳550001）

灵芝红茶抗氧化活性成分的含量测定研究

刘良琴1，2，3，龚小见1，2，3，周欣1，2，3，*，赵超1，2，3，陈华国1，2，3

（1.贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州贵阳550001；2.贵州师范大学贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州贵阳550001；3.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵州贵阳550001）

以灵芝红茶为研究对象，应用DPPH·、ABTS+·和FRAP铁离子还原能力研究灵芝红茶的抗氧化活性，并对灵芝红茶中茶多酚和多糖含量进行测定。结果发现灵芝红茶有清除DPPH自由基、ABTS+自由基和还原FRAP的作用，表明灵芝红茶具有较强的抗氧化活性。灵芝红茶中的茶多酚和多糖含量测定方法中，没食子酸浓度在4.08 μg/mL～16.50 μg/mL范围内线性良好，平均回收率分别为99.6%（RSD=2.52%，n=9）；葡萄糖浓度在40.33 μg/mL～181.50 μg/mL范围内线性良好，平均回收率为100.5%（RSD=1.08%，n=9）。所建立的灵芝红茶中茶多酚和多糖的含量测定方法简便快捷，线性、重复性、精密度和回收率良好。此含量测定方法可用于灵芝红茶生产过程中质量控制。

灵芝红茶；茶多酚；多糖；抗氧化

大量研究证明人体内产生的活性氧自由基及其反应会加速衰老以及诱导各种生活习惯病的发生。抗氧剂能有效清除活性氧自由基，减缓人体衰老，预防疾病。目前，合成抗氧剂在医疗和食品领域使用较为广泛，研究表明合成抗氧剂对生物体有潜在的毒副作用[1]。因此，寻找开发安全无毒副作用的天然抗氧化剂成为当下的研究热点[2]，而保健品的研究开发是一个重要的研究方向。

灵芝红茶是以灵芝和红茶为原料生产的一种具有保健功能的饮品，它同时具有灵芝和红茶的保健功效。灵芝（Ganderma lucidum）具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、提高机体耐缺氧能力[3-4]等活性；茶叶具有提神消疲、养胃护胃、抗衰老、抗癌[5-6]等功效。科学研究表明，茶多酚是红茶中主要活性成分，而多糖类是灵芝提取物中主要活性成分。本文采用体外抗氧化试验对灵芝红茶的抗氧化活性进行初步评价研究，在抗氧化活性研究的基础上，以茶多酚和灵芝多糖为评价指标，采用Folin-Ciocalteu法[7]和苯酚-硫酸法[8]建立了灵芝红茶中茶多酚和多糖含量测定方法，该方法简便快捷，线性、重复性、精密度和回收率良好，可用于控制灵芝红茶产品质量和生产过程中产品质量的在线监测。

1 材料

1.1 主要仪器及试剂

SPECTRA max PLUS 384光吸收酶标仪：美国分子仪器公司Molecular Devices；AL204万分之一分析天平、XS105十万分之一分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDL-5A低速自动平衡离心机：常州市万合仪器制造有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；BSC-150恒温恒湿培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KQ-300DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；明澈TM-D 24UV纯水/超纯水系统：Merck Millipore；Eppendorf research plus微量移液器：德国Eppendorf公司。

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）：贵州迪大生物科技有限公司；TPTZ：Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司；福林酚：上海蓝季科技有限公司；FeCl3、FeSO4乙酸钠、浓硫酸、苯酚、无水碳酸钠：均为分析纯；水为蒸馏水；维生素C、没食子酸、无水葡萄糖：贵州迪大生物科技有限公司（纯度≥98%）。

1.2 茶叶材料

灵芝红茶（批号：020150105、020150615、020150922、020151006、020151028、020151105、020151108、02015-1113、020151105、020151204）：贵州高山黔灵原生态健康品有限公司。

2 方法和结果

2.1 灵芝红茶的抗氧化活性

2.1.1 样品溶液的制备

灵芝红茶样品溶液的制备：灵芝红茶磨碎过20目筛（孔径为0.833 mm）。精密称定灵芝红茶0.2 g，加500.0 mL水，80℃超声提取30 min，离心（3 500 r/min，5 min）取上清液，重复2次，合并提取液，定容到1 000 mL，得灵芝红茶样品溶液。测得其中茶多酚浓度为17.60 μg/mL，总糖浓度为10.50 μg/mL。

VC对照品溶液的制备：精密称定 VC对照品11.01 mg，水溶解，配制成1.0 mg/mL的样品液。使用时用蒸馏水将溶液稀释。

2.1.2 DPPH自由基清除能力的测定[9]

取 0.5 mL灵芝红茶和 VC稀释液与 0.5 mL 250 μmol/LDPPH工作液混合，室温下反应40min，以样品溶液为空白，在517nm处读取吸光度值。计算灵芝红茶、VC对DPPH自由基清除率，结果见图1。

SA（清除率）/%=[（AControl-ASample）/AControl]×100

式中：AControl为0.5 mL DPPH溶液与0.5 mL无水乙醇混合后的吸光度；ASample为 0.5 mL DPPH溶液与0.5 mL样品混合后的吸光度。

图1 DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH·scavenging activity of Ganoderma lucidum black tea

由图1可知，VC对DPPH自由基清除效果随浓度升高而增强，有明显的量效关系，IC50为11.98 μg/mL；灵芝红茶的DPPH自由基清除率为91.78%，相当于26.22 μg/mL VC。

2.1.3 ABTS+自由基清除能力的测定[10]

配制ABTS溶液和K2S2O7溶液，按1∶1比例（体积比）混合，使ABTS和K2S2O7最后浓度分别为7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室温避光条件下放置12 h，形成ABTS储备液。使用无水乙醇将储备液稀释为ABTS工作液，使其在734 nm处的吸光度值为0.80±0.02。

分别取0.5 mL灵芝红茶和VC稀释液与0.5 mL ABTS工作液混合，室温反应20 min，在734 nm读取吸光度值，计算茶多酚、VC对ABTS+自由基清除率，结果见图2。

SA（清除率）/%=[（AControl-ASample）/AControl]×100

式中：AControl为0.5 mL ABTS工作液与0.5 mL无水乙醇混合后的吸光度；ASample为0.5 mL ABTS工作液与0.5 mL样品混合后的吸光度。

由图2可知，VC对ABTS+自由基清除效果随浓度升高而增强，有明显的量效关系，IC50为11.18μg/mL；灵芝红茶的ABTS+自由基清除率为95.87%，相当于23.05 μg/mL VC。

图2 ABTS+自由基清除率Fig.1 ABTS+·scavenging activity of Ganoderma lucidum black tea

2.1.4 FRAP铁离子还原能力测定[11]

将10 mmol/L的TPTZ储备液（用40 mmol/L盐酸溶解，现配现用），20 mmol/L的FeCl3溶液和0.3 mmol/L的醋酸缓冲液（pH 3.6）以1∶1∶10（体积比）混合，制成新鲜的FRAP工作液。取浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/LFeSO4溶液各50 μL，加入1.0 mL TPTZ工作夜，测定吸光度值，绘制标准曲线。得曲线方程：y= 0.712 8 x+0.003 5，γ=0.999 4。还原力以FRAP值表示：1 FRAP单位=1 μmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的摩尔浓度数。

取50 μL灵芝红茶和VC样品液加入1.0 mL新鲜配制的TPTZ工作液，混匀，37℃反应40 min后在593 nm处测定吸光度。计算灵芝红茶、Vc的FRAP值，结果见图3。

图3 FRAP铁离子还原能力Fig.3 FRAP ferric ion reducing antioxidant powder of Ganoderma lucidum black tea

由图3可知，VC对FRAP还原能力随浓度升高而增强，有明显的量效关系；灵芝红茶的FRAP值为638，相当于7.48 μg/mL VC。

2.2 灵芝红茶中茶多酚的含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备

经过单因素结合正交试验，确定灵芝红茶中茶多酚的提取方法如下：取灵芝红茶样品0.2 g，精密称定，置于三角烧瓶中，加入5.0 mL体积分数50%的乙醇，超声提取30 min，离心（3 500 r/min，5 min），取上清液。重复提取两次。合并提取液，定容到10 mL，摇匀，备用。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品10.0 mg，加水溶解，定容到100 mL，摇匀，配制成100 μg/mL的没食子酸对照品溶液。

2.2.3 检测波长的选择

分别取茶多酚供试品溶液50 μL和没食子酸对照品溶液1.0 mL于10 mL具塞试管中，加入1.0 mL Folin-Ciocalteu试剂，室温反应5 min后，加入质量分数为10%NaCO3溶液2.5 mL，定容到10 mL，30℃避光显色50 min后，于400 nm～800 nm范围内进行扫描。结果表明：对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为760 nm。

2.2.4 标准曲线的绘制

分别取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL没食子酸对照品溶液，按照2.2.3项下的方法进行测定。以没食子酸的浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，得曲线方程为y=0.040 23 x+ 0.040 78，γ=0.999 3，结果表明：没食子酸浓度在4.084 μg/mL～16.50 μg/mL范围内线性良好。

2.3 灵芝红茶中多糖的含量测定

2.3.1 供试品溶液的制备

经过单因素结合正交试验，确定灵芝红茶中多糖的提取方法如下：取灵芝红茶样品0.5 g，精密称定，置于三角烧瓶中，加入5.0 mL水，在80℃下超声提取40 min，离心（3 500 r/min，5 min），取上清液。重复提取两次。合并提取液，加入无水乙醇使乙醇的体积分数达到80%，于4℃下醇沉24 h后，离心，倾去上清液，洗涤沉淀，干燥，加水溶解转移到10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

2.3.2 对照品溶液制备

精密称取无水葡萄糖50.0 mg，加水溶解，定容到50 mL，摇匀，配制成1 mg/mL的对照品贮备液。分别取0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖贮备液，定容到10 mL，得不同浓度的葡萄糖系列标准溶液。

2.3.3 检测方法的确定

取多糖供试品溶液0.1 mL于10 mL具塞试管中，加水至1.0 mL，取对照品溶液1.0 mL于另一10 mL具塞试管中，分别加入1.0 mL质量分数为5%的苯酚溶液，再加入5.0 mL浓硫酸，沸水浴10 min，放冷，于400 nm～600 nm范围内进行扫描。结果表明：对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为485 nm。

2.3.4 标准曲线的绘制

取1.0 mL葡萄糖系列标准溶液于试管中，按照2.3.3项下的方法进行处理。以葡萄糖的浓度为横坐标（x），吸光度值为纵坐标（y）绘制标准曲线。得方程为y=0.003 85x+0.007 08，γ=0.999 6，结果表明：葡萄糖浓度在40.33 μg/mL～181.50 μg/mL范围内线性良好。

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性试验

取50 μL多酚样品液6份，按照2.2.3项下的方法处理。以溶剂为空白，分别在0、10、20、30、45、60、90 min后测定吸光度。结果显示，多酚样品液在制备显色后的90 min内稳定。

取0.1 mL多糖供试品溶液6份，分别加入0.9 mL水，按照2.3.3项下的方法处理，以溶剂为空白，分别于0、20、40、60、80、100、120 min后测定吸光度。结果显示，RSD=2.04%（n=6），表明多糖样品液在制备显色后的120 min内稳定。

2.4.2 精密度试验

分别取1.0 mL 100 μg/mL没食子酸溶液6份，按照2.2.3项下的方法进行测定。得结果为0.482、0.482、0.492、0.496、0.481、0.492，平均值为0.488，RSD=1.35%（n=6），表明仪器精密性良好。

分别取1.0 mL 100 μg/mL的葡萄糖溶液6份，按照2.3.3项下的方法进行测定。计算得结果为0.336、0.338、0.331、0.336、0.332、0.333，平均值为0.334，RSD= 0.82%（n=6）。表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验

取灵芝红茶（批号：020150922）样品6份，按照2.2项下的方法进行测定。测得茶多酚的平均含量为131.5 mg/g，RSD=1.34%（n=6），表明本方法的重复性良好。

取灵芝红茶（批号：020150922）样品6份，按照2.3项下的方法进行测定。测得多糖平均含量为25.71 mg/g，RSD=1.58%（n=6），表明本方法的重复性良好。

2.4.4 加样回收试验

取灵芝红茶（批号：020150922）样品0.1 g 9份，3个一组，分别加入茶多酚含量80%、100%、120%的没食子酸对照品，按照2.2项下的方法进行测定。结果见表1。计算平均回收率为99.6%，RSD=2.52%（n=9）。

取灵芝红茶（批号：020150922）样品0.25 g 9份，3个一组，按照2.3.1项下的方法进行制备，再分别加入多糖含量80%、100%、120%的葡萄糖对照品，按照

2.3.3项下的方法进行测定。结果见表1。平均回收率为100.5%，RSD=1.08%（n=9）。

表1 茶多酚和多糖的加样回收试验Table 1 Recoveries of the tea polyphenols and total polysaccharides

2.5 样品测定

取灵芝红茶样品按照2.2项下的方法进行测定，每个样品平行3份。使用外标法计算茶多酚的含量，结果见表2。

表2 不同批次灵芝红茶中茶多酚和多糖的含量Table 2 The content of tea polyphenols and polysaccharides in different batches Ganoderma lucidum black tea

取灵芝红茶样品按照2.3项下的方法进行测定，每个样品平行3份。使用外标法计算总多糖的含量，结果见表2。

3 结论

本试验应用DPPH自由基、ABTS+自由基和FRAP铁离子还原能力对灵芝红茶的抗氧化性进行测定，以维生素C（VC）为阳性对照。通过测定灵芝红茶对DPPH自由基的清除能力、ABTS+自由基清除能力、FRAP铁离子还原能力来表征其抗氧化能力。结果显示：VC对DPPH自由基和ABTS+自由基半数抑制浓度分别为11.98、11.18 μg/mL，灵芝红茶的DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率分别为91.78%、95.87%，分别相当于26.22、23.05 μg/mL VC；灵芝红茶的FRAP值为638，相当于7.48 μg/mL VC。表明灵芝红茶有较强的抗氧化能力，从而证实了灵芝红茶是具有较好抗氧化作用的保健品。

采用紫外吸光光度法建立了灵芝红茶中的茶多酚和多糖含量测定方法，在该方法中，没食子酸浓度在4.08 μg/mL～16.50 μg/mL范围内线性良好，平均回收率分别为99.6%（RSD=2.52%，n=9）；葡萄糖浓度在40.33 μg/mL～181.50 μg/mL范围内线性良好，平均回收率为100.5%（RSD=1.08%，n=9）。所建立的灵芝红茶中茶多酚和多糖的含量测定方法简便快捷，线性、重复性、精密度和回收率良好。并采用所建立的方法对不同生产批次灵芝红茶中茶多酚和多糖的含量进行了测定。综上所述，所建立的灵芝红茶中茶多酚和多糖的含量测定方法操作简便，快速，适合用于灵芝红茶的质量控制和产品生产过程的在线监测。

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Research on the Content of Antioxidant Active Ingredient in Ganoderma lucidum Black Tea

LIU Liang-qin1，2，3，GONG Xiao-jian1，2，3，ZHOU Xin1，2，3，*，ZHAO Chao1，2，3，CHEN Hua-guo1，2，3
（1.Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China；2.Guizhou Engineering Laboratory for Quality Control&Evaluation Technology of Medicine，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China；3.The Research Center for Quality Control of Natural Medicine，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China）

Antioxidant activity of Ganoderma lucidum black tea had been studied by the experiment in vitro，included DPPH free radical，ABTS+free radical，FRAP.And the method was abtained that determination the content of tea polyphenols and Ganoderma lucidum polysaccharide in Ganoderma lucidum black tea with ultraviolet absorption spectrometry.In conclusion，Ganoderma lucidum black tea exhibited promising antioxidant activity.Gallicacidandglucosehadexcellentlinearitywithintheconcentrationrangein4.08 μg/mL-16.50μg/mL，40.33 μg/mL-181.50 μg/mL respectively under this method，the average recoveries were as follows：99.6%（RSD=2.52%，n=9），100.5%（RSD=1.08%，n=9）.The methods had the advantage of quick and simple，feasible，and linearity，repeatability，precision and recovery.This method could be used to determine the content of tea polyphenol and polysaccharide in Ganoderma lucidum black tea.

Ganoderma lucidum black tea；tea polyphenols；polysaccharides；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.029

2016-09-23

贵州师范大学研究生创新项目基金（研创2015021号）；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合中药字[2013]5001号）；贵州省高层次创新人才培养项目（黔科合人才（2015）4033号）

刘良琴（1991—），女（汉），在读硕士，研究方向：药用植物开发与利用。

*通信作者：周欣，女，教授，博士生导师。