香菇PPO超声辅助法提取工艺及酶学特性的研究

韩春然，黄赫雁，李煜，戴传荣，林枞雨，张家成

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

香菇PPO超声辅助法提取工艺及酶学特性的研究

韩春然，黄赫雁，李煜，戴传荣，林枞雨，张家成

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

对超声波辅助浸提法提取香菇中多酚氧化酶的工艺进行研究，并考察香菇中多酚氧化酶的酶学特性，并对3种抑制剂对多酚氧化酶的抑制效果进行比较。结果表明：最优提取工艺为：磷酸缓冲液中添加的PVPP含量为2.0%，超声时间150 s，固液比为3∶5（g/mL）；香菇中多酚氧化酶的最适pH值为6.9，最适温度为40℃，选取邻苯二酚为底物时，其最适浓度为0.3 mol/L，3种抑制剂对香菇中多酚氧化酶均有抑制作用，抑制效果为抗坏血酸＞柠檬酸＞乳酸，其中抗坏血酸在浓度为2 g/L时，抑制效果为对照组的8.42%。

香菇；多酚氧化酶；提取；超声辅助；酶学特性；抑制

香菇（Lentinus edodes，Shiitake）属伞菌目，口蘑科，香菇属，又名冬菇、香蕈、北菇、花菇，是世界上第二大食用菌。香菇是在木材中生长的，素有“山珍之王”之称，它具有高蛋白、低脂肪，适合大多数人群。香菇菌肉白色，稍厚或厚，细密，具香味。香菇采收后，在常温下容易发生褐变，尤其是受机械损伤后褐变更加迅速[1]。香菇褐变被视为香菇鲜度下降的主要标志。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是导致香菇酶促褐变的主要酶类，引起香菇变黑甚至腐烂，导致品质下降。多酚氧化酶催化香菇中的内源性多酚物质氧化为醌类化合物，使高活性亲电子的分子能够聚合，导致褐色或黑色色素的形成。严重影响了产品的营养价值、风味等[2-3]。为进一步研究多酚氧化酶的特性，对香菇中的多酚氧化酶的提取方法（超声波辅助浸提法）的提取工艺进行了研究，考察了不同pH值、温度和底物浓度（底物为邻苯二酚）对PPO（多酚氧化酶）活性的影响，并对柠檬酸、抗坏血酸及乳酸3种抑制剂对多酚氧化酶的抑制效果进行探究。为抑制香菇在贮藏及加工过程中的酶促褐变提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇：采摘于哈尔滨玉丰菌业香菇生产基地；磷酸二氢钠（分析纯）：天津市风船化学试剂有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）、三氯乙酸（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；邻苯二酚（教学试验用）：天津市巴斯夫化工有限公司；交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）（分析纯）：广东粤美化工有限公司。

1.2 主要仪器

TGL-18C高速冷冻离心机：湖南星科科学仪器有限公司；UV-5200紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；电子天平：上海光正医疗仪器有限公司；DK-98-11A恒温数显水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；JY98-111DN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制备

取新鲜的香菇50 g加pH值为6.9的含2%的PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮）[4]的磷酸缓冲液50 mL，匀浆，搅拌，然后在600 W功率的超声波提取机上处理一段时间，静置40 min，8 000 r/min下离心10 min。取上清液于4℃冰箱保存。

1.3.2 多酚氧化酶活性测定

取一只试管A加入5 mL pH6.9的磷酸缓冲液，在40℃温度下水浴10 min，加入40℃预热的酶液1 mL，再加入1 mL浓度为20%的三氯乙酸[5-6]溶液使酶失活，然后加入1 mL浓度为0.3 mol/L邻苯二酚，摇匀，8 000 r/min离心5 min，取上清液，在410 nm处测定溶液吸光光度值，此为反应开始时的数值。同时以缓冲溶液替代酶液做相同处理，作为空白对照。再另取一只试管B加入5 mL pH6.9的磷酸缓冲液，加入1 mL浓度为0.3 mol/L邻苯二酚，摇匀，在40℃温度下水浴10min，加入1mL预热的酶液同时开始计时，3min后立即加入1 mL浓度为20%的三氯乙酸溶液，8 000 r/min离心5 min，取上清液，采用分光光度计在波长410 nm处测定溶液的吸光光度值，此为反应终止时的数值。同时以缓冲溶液替代酶液做相同处理，作为空白对照。

1.3.3 多酚氧化酶酶活计算

多酚氧化酶活力单位定义为在测定条件下，每毫升样品每分钟引起吸光度值改变0.001，则定义为1个酶活单位[U/（g·min）]，样品中的多酚氧化酶的活力按下式方程计算[7]：

式中：R为多酚氧化酶活性，U/（g·min）；△A为反应时间内吸光度值的变化；Vt为酶提取液的总体积，mL；W为香菇的鲜重，g；Vs为参加反应的酶液体积，mL；T为反应时间，单位min。

2 结果与分析

2.1 PVPP的添加量对香菇中PPO提取效果的影响

取新鲜香菇50 g加pH值为6.9的磷酸缓冲液50 mL，分别加入1%、1.5%、2%、2.5%、3%的PVPP。进行匀浆，匀浆均匀后搅拌5 min，静置30 min，在高速离心机中8 000 r/min离心10 min。取上清液于水浴锅中40℃恒温水浴10 min，分别测定酶活性。PVPP添加量对香菇中PPO提取的影响见图1。

图1 PVPP添加量对香菇中PPO提取的影响Fig.1 Effect of PPVP on the PPO extraction of mushroom

由图1可以看出酶活性在PVPP为1%～3%间先升高后降低，PVPP对溶液中多酚有吸附作用，可以排除酚类杂质对溶解率的干扰，使多酚氧化酶更充分地溶解在缓冲溶液中，在PVPP含量为2.5%时酶活性最高。

2.2 超声波处理时间对香菇中PPO提取结果分析

取新鲜香菇50 g加pH值为6.9的含2.5%PVPP的磷酸缓冲液50mL，进行匀浆，匀浆均匀后搅拌5min，在600 W功率的超声波细胞破碎仪上，分别进行60、90、120、150、180 s处理，静置30 min后，在高速离心机中8 000 r/min离心10 min。取上清液于水浴锅中40℃恒温水浴10 min，分别测定酶活性。超声时间对香菇中PPO提取的影响见图2。

图2 超声时间对香菇中PPO提取的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the PPO extraction of mushroom

由图2可以看出，酶活性随着超声波处理时间的增加先升高然后降低，在150 s时酶活性最高，分析原因主要是随着超声波处理时间的延长，气泡的形成及高频振荡越强烈，吸收的声能越大，破壁效果越好，能够增加酶溶解的量。但不是超声的时间越长，酶浓度越高，处理时间太长，由于强烈的冲击和热效应的影响使得提取物被破坏，尤其是酶类，超声时间过长，使得酶的活性降低[8]。

2.3 固液比对香菇中PPO提取结果分析

取新鲜香菇进行匀浆，匀浆均匀后搅拌5 min，配制不同固液比为1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5（g/mL）的提取液，在600 W功率的超声波细胞破碎仪上，进行150 s处理，进行超声波处理，搅拌，离心，萃取上清液，测定酶活性。固液比对香菇中PPO提取的影响见图3。

图3 固液比对香菇中PPO提取的影响Fig.3 Effect of the solid liquid ratio on the PPO extraction of mushroom

由图3可以看出酶活性随着固液比变化先升高再降低，在固液比3∶5（g/mL）时酶活性最高，分析其原因为随着固液比增大，细胞内与溶剂之间浓度梯度增大，促进多酚氧化酶提取，但当固液比过高，会发现溶液变黏稠，则原料颗粒被破碎的机会越小，影响超声效果，不利于酶的溶出，酶活性降低[9]。

2.4 提取法正交试验结果分析

根据以上单因素试验结果分析，选取吸附剂PVPP添加量、超声波处理时间、固液比3个主要因素，进行三因素三水平正交试验。其中吸附剂PVPP选择2.0%、2.5%、3.0%组添加量，超声时间选择180、240、300 s，固液比选择2∶5、3∶5、4∶5（g/mL）3组作为正交试验水平；由最优组合基础上进行正交试验，确定最优提取工艺，对以后研究香菇中PPO的酶学特性提供基础。根据表1进行L9（34）正交试验设计，确定最优提取工艺。正交试验因素与水平设计表见表1，正交试验结果分析表见表2。

表1 正交试验因素与水平设计表Table 1 Orthogonal test factors and levels

表2 正交试验结果分析表Table 2 Orthogonal test results

由表2可以得出，正交试验因素主次顺序为A＞B＞C，即PVPP含量＞超声时间＞固液比，最优提取工艺为A1B2C2，即PVPP含量为2.0%，超声时间为150 s，固液比为3∶5（g/mL）。

2.4 pH值对多酚氧化酶活性的影响

按照1.3.2方法测定香菇中多酚氧化酶活性，取磷酸盐缓冲液pH值分别为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，以不加酶溶液的反应体系溶液为参比液，测定酶活性。pH值对多酚氧化酶活性的影响见图4。

图4 pH值对多酚氧化酶活性的影响Fig.4 Effect of pH on the determination of PPO activity

从图4可以看出，香菇PPO活性受pH值的影响，随着pH值的增加，酶活性逐渐增加，pH值为7.0时活性最高。当pH值增加，PPO活性下降，原因为PPO是铜氧化酶，pH值过高或过低将导致铜离子的解离和蛋白质的变性[10]，使酶失去活性。

2.5 温度对多酚氧化酶活性的影响

测定多酚氧化酶活性时，设置水浴温度分别为20、30、40、50、60℃，冷却后测定吸光度值，计算酶活性。温度对多酚氧化酶活性的影响见图5。

图5 温度对多酚氧化酶活性的影响Fig.5 Effect of temperature on the determination of PPO activity

由图5可知，随着温度的升高，溶液中分子的热运动加剧，使得底物与酶接触的几率增高，酶活性增大；随着温度的继续升高，酶蛋白受热变性，酶活性降低，最适温度的大小是这两种作用相平衡的结果[11]。本试验中考虑最适温度为40℃。据文献报道，双孢菇[12]、秀珍菇[13]、鸡腿蘑[14]、草菇[15]的最适温度分别为20、35、45、35℃。因此可以看出，PPO的最适温度与原料的来源及底物的种类有关。

2.6 底物浓度对多酚氧化酶活性的影响

设定邻苯二酚浓度分别为 0.1、0.2、0.25、0.3、0.4 mol/L。为了进一步研究底物浓度对酶促反应的影响，计算该酶的Km（米氏常数）值和该酶促反应的Vmax（最大速度）值。以单位时间内单位体积的产物生成量来表示该酶促反应的速度，将酶促反应速度的倒数（1/V）对底物浓度的倒数（1/[S]）作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴上的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。底物浓度对多酚氧化酶活性的影响见图6，以邻苯二酚为底物时Lineweaver-Burk曲线见图7。

图6 底物浓度对多酚氧化酶活性的影响Fig.6 Effect of the substrate concentration on the determination of PPO activity

图7 以邻苯二酚为底物时Lineweaver-Burk曲线Fig.7 The Lineweaver-Burk curve with substrate of catechol

由图7可知，Vmax=1/0.622 8=1.605 7 min/A410，Km= 1/0.558 3=1.791 2 mol/L。拟合直线为y=0.513 7x+ 1.049 7，相关系数r=0.975 7，表明香菇中PPO对邻苯二酚有很好的亲和力。酶催化反应的初始阶段与邻苯二酚底物浓度成正比。结合图6可得，选取底物浓度为0.3 mol/L的用量较为适宜。

2.7 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响

以0.3 mol/L的邻苯二酚为底物，pH值为6.9的磷酸盐作为缓冲溶液，在最适温度条件下，以下列物质作为抑制剂：柠檬酸（0、1、2、3、4、5 g/L），VC（0、1、2、3、4、5 g/L），乳酸（0、1、2、3、4、5 g/L）。在410 nm处测定吸光度值，计算酶活力。抑制剂浓度对PPO活力的影响见图8。

由图8可知，柠檬酸、抗坏血酸、乳酸均能抑制多酚氧化酶活性，其抑制效果为抗坏血酸＞柠檬酸＞乳酸。柠檬酸使酶反应体系的pH值发生改变以及它与铜辅基络合使得柠檬酸对PPO有抑制效果。随着柠檬酸量的增大，pH值降低，逐渐不适宜PPO所需的条件，并且柠檬酸对PPO的活性中心的铜离子具有较强的螯合作用，故吸光度迅速降低[16]。选择浓度为3 g/L的柠檬酸对PPO进行抑制，此时PPO的活性仅为对照的25.77%。

图8 抑制剂浓度对PPO活力的影响Fig.8 Effect of inhibitors on the determination of PPO activity

抗坏血酸作为一种有机酸有很好的防褐变效果，VC具有还原性，对PPO活性起到一定抑制效果。其抑制机理是它与中间产物邻苯二醌作用生成邻二酸和脱氢抗坏血酸，防止了中间产物进一步聚合成黑色素。在实际生产中抗坏血酸是较为理想的PPO抑制剂，它既具有较好的抑制效果，又是食品中固有的营养成分，安全性高。但是抗坏血酸本身易于被氧化，所以要使其能保持一定的抑制效果就要保持其含量的稳定[17]。本试验中选择浓度为2 g/L的VC抑制多酚氧化酶，其活性仅为对照的8.42%。

乳酸作为一种抗褐变的有机酸常被用于食品工业中。PPO的相对酶活性随着乳酸处理浓度的增大而减小；其原因为不同浓度乳酸处理PPO可能引起PPO三级结构的破坏，从而导致PPO活性的降低[18]。本试验中选择浓度3 g/L的乳酸对多酚氧化酶进行抑制，其活性为对照的34.0%。

3 结论

超声波辅助浸提法提取香菇中多酚氧化酶的最佳工艺为：选取磷酸缓冲液，添加含量为2.0%的吸附剂PVPP，超声时间150 s，固液比为3∶5（g/mL）；香菇中多酚氧化酶的最适pH值为6.9，最适温度为40℃，选取邻苯二酚为底物时，其最适浓度为0.3 mol/L，柠檬酸、抗坏血酸、乳酸对香菇中多酚氧化酶均有抑制作用，抑制效果为抗坏血酸＞柠檬酸＞乳酸，其中抗坏血酸在浓度为2 g/L时，抑制效果可达到对照组的8.42%。

[1]刘雅嘉,李炜,衣杰荣.香菇多酚氧化酶酶学特性的研究[J].食品工业科技,2009,30(1)：183-185,188

[2]COLAK A,SAHIN E,YILDIRIM M,et al.Polyphenol oxidase potentials of three wild mushroom species harvested from Lier High Plateau,Trabzon[J].Food chemistry,2007,103(4)：1426-1433

[3]GAWLIK-DZIKI U,ZLOTEK U,WIECA M.Characterization of polyphenol oxidase from butter lettuce(Lactuca sativa var.capitata L.)[J].Food Chemistry,2008,107(1)：129-135

[4]李云飞,戴前颖,夏涛.添加PVPP对绿茶汤色的影响及作用机理的研究[J].食品工业科技,2012,33(22)：127-132

[5]莫祺晖,韦星明,李槐.三氯乙酸终止液对木瓜蛋白酶酶活测定的影响研究[J].饮料工业,2015(1)：23-25

[6]滕昆,张吉福,牛福星.脂肪酶活力测定中终止反应方法的比较分析[J].广西科学,2014(2)：115-118

[7]周小玲,杨代明,李娜.小麦粉多酚氧化酶活性测定方法的改进[J].食品与机械,2015(6)：84-87

[8]王文宗,李琳,林鸿佳.超声波对多酚氧化酶酶活力的影响及其机理[J].食品科学,2010(17)：331-334

[9]熊海涛,郑行望,唐志华.超声诱导法提取香蕉中多酚氧化酶的工艺研究[J].食品研究与开发,2011,32(5)：24-26

[10]邵伟,乐超银,黄艺.蘑菇多酚氧化酶酶学特性初步研究[J].食用菌,2007,29(2)：5-6

[11]赵吉顺.香菇、双孢菇液态CO2速冻工艺研究[D].昆明：昆明理工大学,2011

[12]吴进菊.双孢蘑菇多酚氧化酶的研究[D].南昌：南昌大学,2010

[13]耿中华,王乃馨.秀珍菇多酚氧化酶的特性研究[J].食品工业, 2014(1)：116-119

[14]李君兰,李怡华,赵秋玲.鸡腿蘑多酚氧化酶特性研究[J].食品科学,2007,28(1)：187-191

[15]于新,冯彤,黄小丹.草菇多酚氧化酶及过氧化物酶活性的抑制研究[J].仲恺农业技术学院学报,2000,13(2)：14-17,26

[16]倪文兵,童军茂.红枣多酚氧化酶酶促褐变控制研究[J].食品工业科技,2012,33(4)：205-208

[17]高梦祥,杨凤琴.冬瓜多酚氧化酶的特性及抑制剂研究[J].食品科技,2008,33(2)：11-14

[18]方志超,周磊,刘伟.乳酸对多酚氧化酶活性与构象的影响[J].食品工业科技,2014(16)：117-120

The Research on Ultrasonic-Assisted Extraction and Enzyme Properties of PPO in Lentinus edodes

HAN Chun-ran，HUANG He-yan，LI Yu，DAI Chuan-rong，LIN Zong-yu，ZHANG Jia-cheng
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，Heilongjiang，China）

This paper studied the ultrasonic-assisted extraction of mushroom，examined the enzymatic properties of polyphenol oxidase in mushroom，and compared the polyphenol oxidase inhibiting effect of three inhibitors.Results showed that PVPP content was 2.0%，ultrasonic time 150 s，the solid liquid ratio 3∶5（g/mL）；The optimal conditions of polyphenol oxidase activities in mushroom were pH 6.9，temperature 40℃，the concentration 0.3 mol/L with the substrate of catechol.Three inhibitors had inhibition in polyphenol oxidase in mushroom.The inhibiting effect was VC＞citric acid＞lactic acid.In the concentration of 2 g/L，the inhibiting effect of VCwas 8.42%in the control group.

Lentinus edodes；polyphenol oxidase；extraction；ultrasound-assisted；enzymatic characteristics；inhibitor

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.010

2016-09-21

韩春然（1970—），女（汉），教授，博士，研究方向：果蔬贮藏与加工。