钝顶螺旋藻藻蓝蛋白储存稳定性研究

徐润，陈野，孙平

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白储存稳定性研究

徐润，陈野*，孙平

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

对温度、日光光照等条件以及不同添加剂对藻蓝蛋白水溶液稳定性的影响进行研究。研究得出，藻蓝蛋白应低于40℃避光保存，应于中性条件下保存；葡萄糖、氯化钠和山梨糖醇可以有效提高藻蓝蛋白的稳定性，分别于室温放置72 h后藻蓝蛋白色素保存率从50.90%提高到了78.10%、67.02%和69.08%；按质量比1∶1∶0.3复合葡萄糖、氯化钠和山梨糖醇作为稳定剂加入藻蓝蛋白后于4℃放置14 d，藻蓝蛋白色素保存率比未加添加剂的藻蓝蛋白提高54.4%；于25℃下放置，加了复合添加剂的藻蓝蛋白色素保存率比未加添加剂的提高16.1%。

藻蓝蛋白；添加剂；稳定性；复合

螺旋藻（英文学名为spirulina），又称“节旋藻”，属于蓝藻纲，颤藻科；目前国内外能够进行大规模培育的有极大螺旋藻、钝顶螺旋藻和印度螺旋藻三类。钝顶螺旋藻是一种蓝绿色的海藻（藻青菌），属于念珠藻。它是一种无支链、多细胞的螺旋状菌丝，长约200 μm～300 μm，宽约5 μm～10 μm[1]。钝顶螺旋藻所含蛋白质的氨基酸组成分布十分均匀合理，这表明了其可作为人类有潜力的保健食品[2]。

藻蓝蛋白属于藻胆蛋白中可进行光合作用的一种蛋白质，藻胆蛋白是由α和β亚基组成的发色团多肽，分子量大约在20 000道尔顿[3]。蓝藻菌钝顶螺旋藻中的藻胆蛋白体是由位于中心的别藻蓝蛋白和其周围的藻蓝蛋白构成的。藻蓝蛋白是螺旋藻中最主要的藻胆蛋白，占到干重的20%左右[4-6]。其在水溶液中呈现蓝色，并且有紫色荧光。钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的紫外-可见光光谱在278、360、620 nm处有特征吸收峰[7]。还有研究表明，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的最大吸收峰为620 nm处，其在室温中的荧光发射峰位于645nm处[8]。

天然色素种类十分丰富，分类依据有很多种。按溶解性可分为脂溶性色素、水溶性色素；按来源可分为动物色素、微生物色素和植物色素；以不同的化学结构分类则为花青素、类胡萝卜素等5类[9-10]。

藻蓝蛋白是一种天然的蓝色色素，具有很高的应用价值。有研究表明，藻蓝蛋白可以抗癌[11-12]，其还可以作为肠炎病患者的保健食物[13]。藻蓝蛋白具有很强的水溶性，并且可以很容易的从螺旋藻中提取出来。在提取及分离纯化过程中，适当的pH值、离子强度的控制对于藻蓝蛋白的稳定性是十分关键的。藻蓝蛋白的褪色变性是由蛋白质聚合物的等级决定的，其聚合体形式主要受到光照强度、光照时间、温度、pH值、辐射和蛋白质浓度的影响[14-17]。

目前已有研究得到，较高浓度的氯化钠对于藻蓝蛋白的稳定性有保护作用；适量的苯甲酸钠也可以对藻蓝蛋白进行一定程度的护色、防腐[18-19]，但是藻蓝蛋白的稳定性仍然较低。因此，本试验在以往研究的基础上，进行了不同食品级添加剂以及葡萄糖、氯化钠和山梨糖醇复合添加剂对藻蓝蛋白稳定性影响的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

钝顶螺旋藻藻粉：内蒙古乌审召生态产业发展有限公司。

FD-10冷冻干燥机：北京德天佑科技发展有限公司；756PC紫外分光光度计：天津普锐斯仪器有限公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；85-2数显控温磁力搅拌器：上海君竺仪器制造有限公司。

1.2 藻蓝蛋白的提取及纯化

1.2.1 藻蓝蛋白的提取[19]

取适量螺旋藻粉按料液比1∶40（质量比）溶于蒸馏水，搅拌转子以1 000 r/min的转速搅拌1.5 h，-18℃下冷冻，24 h后在37℃水浴中急融，反复4次后在10 000 r/min的速度下高速离心10 min，取上清液稀释适当倍数后测620、280 nm处的吸光值。

1.2.2 藻蓝蛋白的纯化[17]

取浓度为5 mg/mL的藻蓝蛋白粗提液，缓慢加入硫酸铵固体至饱和度为40%，同时进行磁力搅拌至完全溶解，在4℃下静置2 h后以10 000 r/min的速度离心15 min，收集沉淀后，溶于适量蒸馏水中，透析后冻干备用。

1.3 藻蓝蛋白储藏稳定性的研究

1.3.1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响[19]

将30 mg藻蓝蛋白溶解在30 mLpH值为5.0、6.0、7.0的柠檬酸磷酸缓冲液中，置于6个温度梯度（20、30、40、50、60、70℃）中培养30 min。稀释适当倍数后在620 nm处测吸光值，计算其色素保存率。色素保存率按式（1）进行计算：

1.3.2 日光光照对藻蓝蛋白稳定性的影响[19]

取1 mg/mL的藻蓝蛋白水溶液两组，一组于单一光源（日光）下照射，另一组避光保存，分别于12、24、36、48、60、72 h后适当稀释，在620 nm处测吸光值，比较藻蓝蛋白色素保存率的变化。

1.3.3 pH值对藻蓝蛋白稳定性的影响

取0.1 g藻蓝蛋白粉溶于100 mL pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的柠檬酸磷酸缓冲液中，共5组，每隔30 min取样适当稀释，在波长620 nm处测吸光值，比较藻蓝蛋白色素保存率的变化。

1.3.4 食品添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响[20-21]

取100 mL浓度为1 mg/mL的藻蓝蛋白溶液，根据GB 2760-2011《食品添加剂使用标准》规定的食品添加剂最大添加量的要求，依次加入下列添加剂：葡萄糖（5 g）、蔗糖（5 g）、氯化钠（5 g）、山梨糖醇（0.003 g）、苯甲酸钠（0.000 2 g）、抗坏血酸（0.002 g）。室温日光下放置24、48、72 h后适当稀释，测其在620 nm处的吸光值，比较藻蓝蛋白色素保存率的变化。分别取不同浓度的葡萄糖、氯化钠按以上方法测其对藻蓝蛋白稳定性的影响。选择适宜浓度的葡萄糖、氯化钠和适量山梨糖醇复合后加入藻蓝蛋白水溶液，按以上方法进行试验，观察其色素保存率的变化。

2 结果与分析

2.1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响

温度对藻蓝蛋白稳定性的影响见图1。

由图1可得，藻蓝蛋白在不同温度下放置30 min，其色素保存率随着温度的上升而下降。当温度在20℃～40℃之间时，藻蓝蛋白的色素保存率几乎没有变化；50、60℃下存放的藻蓝蛋白在30 min后色素保存率分别比最初降低了11.68%、20.71%，而70℃下存放的藻蓝蛋白的色素保存率降低幅度最大，比最初降低了58.58%。

图1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.1 The influence of temperature on stability of phycocyanin

高温会破坏藻蓝蛋白的结构使其变性，导致藻蓝蛋白色素保存率降低。由测定的结果可看出，藻蓝蛋白在20℃～40℃之间时色素保存率最大，最稳定。因此，应该低于40℃避免高温保存。

2.2 光照对藻蓝蛋白稳定性的影响

日光光照对藻蓝蛋白稳定性的影响见图2。

图2 日光光照对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.2 The influence of daily light on stability of phycocyanin

由图2可以看出，藻蓝蛋白溶液在室温、单一日光光源照射下，从48 h开始色素保存率大幅度下降，同时可看出褪色也比较明显，48 h开始颜色逐渐由宝蓝色变为淡蓝色，在60 h时几乎呈现无色透明，其色素保存率比0 h时下降了59.31%，72 h后色素保存率仅为最初的29.26%。藻蓝蛋白在避光条件下室温储存时，色素保存率比日光照射的高，但是影响不是很大，72 h时其比日光照射的藻蓝蛋白色素保存率高13.51%。由此可以得出，藻蓝蛋白对于热的敏感度大于其对光照的敏感度，但是光照对于藻蓝蛋白的色素稳定性也有一定的影响。因此，藻蓝蛋白应在避光条件下保存更为适宜。

2.3 pH值对藻蓝蛋白稳定性的影响

pH值对藻蓝蛋白稳定性的影响见图3。

图3 pH值对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.3 The influence of pH on stability of phycocyanin

图3显示了藻蓝蛋白溶液在pH5.0、5.5、6.0、6.5时色素保存率变化幅度较小，色素保存率一直保持在95.49%～102.19%之间；并且可以看出藻蓝蛋白在pH6.0时最稳定，其色素保存率最高。在pH7.0时，色素保存率下降幅度较大，由最初的100%逐渐降低到87.46%。这可能是由于碱性条件破坏了藻蓝蛋白的结构，因此应该在中性条件下保存，避免在碱性条件下保存。

2.4 添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响

食品添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响见图4。

图4 食品添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.4 The influence of food additives on stability of phycocyanin

图4表明加了不同添加剂的藻蓝蛋白溶液中的藻蓝蛋白色素保存率在室温日光下存放72 h的过程中均先增大后减小。这可能是由于最初藻蓝蛋白未能完全溶解造成的。其中，添加了葡萄糖、山梨糖醇和抗坏血酸的藻蓝蛋白色素保存率最高，分别从最初的100%降低到了78.10%、69.08%、67.24%；明显高于空白对照组的50.90%。这可能是由于添加剂对藻蓝蛋白起到护色、防腐的作用，从而提高了其色素保存率。然而，加了抗坏血酸的藻蓝蛋白溶液产生了大量沉淀。因此，本试验选择葡萄糖、氯化钠和山梨糖醇进行进一步研究。

2.5 葡萄糖浓度对藻蓝蛋白稳定性的影响

葡萄糖浓度对藻蓝蛋白稳定性的影响见图5。

图5 葡萄糖浓度对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.5 The influence of the concentration of glucose on stability of phycocyanin

由图5可得，加了葡萄糖的藻蓝蛋白的色素保存率在24 h后有一定程度的增大，之后又随着时间的增大而减小。这可能是因为葡萄糖对藻蓝蛋白起到护色作用。未加葡萄糖的藻蓝蛋白在室温放置24 h后，其色素保存率变化不大。当加入葡萄糖浓度在10 mg/mL时，放置24 h后的藻蓝蛋白吸光值大幅度增大，藻蓝蛋白的色素保存率比最初增大了16.15%，比未加防腐剂的藻蓝蛋白色素保存率高12.62%；放置72 h后，加了10 mg/mL葡萄糖的溶液色素保存率达到78.09%，比未加葡萄糖的溶液色素保存率高27.19%，之后随着葡萄糖溶液浓度增大，藻蓝蛋白色素保存率趋于平缓。因此，出于节约成本的目的，本试验选择10 mg/mL的葡萄糖进行下一步研究。

2.6 氯化钠浓度对藻蓝蛋白稳定性的影响

氯化钠浓度对藻蓝蛋白稳定性的影响见图6。

图6 氯化钠浓度对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.6 The influence of the concentration of sodium chloride on stability of phycocyanin

由图6可以看出，未加入氯化钠的藻蓝蛋白在放置24 h后，色素保存率几乎无变化，而放入了氯化钠的藻蓝蛋白吸光值均有所上升，这是由于氯化钠对藻蓝蛋白起到护色、抑制其变性的作用。其中，放入浓度10 mg/mL的氯化钠的藻蓝蛋白溶液在放置72 h后，色素保存率明显高于空白对照组，达到75.90%，随后趋于平缓。因此，考虑到节约试验成本，本试验选择10 mg/mL的氯化钠进行下一步研究。

2.7 山梨糖醇、氯化钠和葡萄糖对藻蓝蛋白稳定性的影响

山梨糖醇、氯化钠和葡萄糖对藻蓝蛋白稳定性的影响见图7。

图7 山梨糖醇、氯化钠和葡萄糖对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.7 The influence of sorbitol，sodium chloride，glucose on stability of phycocyanin

图7显示了3种添加剂对藻蓝蛋白的复合护色作用。藻蓝蛋白溶液在室温日光下放置24 h后色素保存率均有不同程度的上升，这是因为添加剂具有护色作用。其中，空白组的藻蓝蛋白溶液24 h后色素含量几乎不变，之后迅速下降；同时加入山梨糖醇、葡萄糖和氯化钠的藻蓝蛋白溶液吸光值上升最为明显，比0 h时的色素保存率高41.29%，比未加添加剂的藻蓝蛋白色素保存率高38.38%；放置72 h后，色素保存率比空白对照组高出23.01%，护色效果明显。加了山梨糖醇的藻蓝蛋白的稳定性其次，室温日光下放置72 h后其色素保存率比空白对照组高19.09%。这是由于山梨糖醇、葡萄糖和氯化钠的复合作用对藻蓝蛋白起到良好的护色防腐的作用，比其他几种组合的添加剂效果更好。因此，可在藻蓝蛋白中按1∶1∶0.3的质量比加入山梨糖醇、葡萄糖和氯化钠作为复合稳定剂。

2.8 3种添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响

藻蓝蛋白（未加添加剂）和藻蓝蛋白（加添加剂）在（4±5）℃和（25±5）℃初始图片见图8，14 d后藻蓝蛋白（未加添加剂）和藻蓝蛋白（加添加剂）在（4±5）℃和（25±5）℃图片见图9，3种添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响见图10。

图8 藻蓝蛋白（未加添加剂）和藻蓝蛋白（加添加剂）在（4±5）℃和（25±5）℃初始图片Fig.8 The initial picture of phycocyanin（no additives）and phycocyanin（with additives）in（4±5）℃and（25±5）℃

图9 14 d后藻蓝蛋白（未加添加剂）和藻蓝蛋白（加添加剂）在（4±5）℃和（25±5）℃图片Fig.9 Picture of phycocyanin（no additives）and phycocyanin（with additives）in（4±5）℃and（25±5）℃after 14 days

图10 3种添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响Fig.10 The influence of three kinds of additives on stability of phycocyanin

图8、图9和图10显示了藻蓝蛋白添加葡萄糖、氯化钠和山梨糖醇作为复合稳定剂后放置14 d的色素含量变化。藻蓝蛋白溶液的色素保存率随着储存天数的增多而减小，不同条件下储存的色素保存率变化也不同。其中，最适合藻蓝蛋白溶液的储存条件是4℃加防腐剂保存，其色素保存率经过14 d的存放后仅下降了30.21%；比4℃下未加添加剂的藻蓝蛋白色素保存率高出54.5%。然而，未加添加剂的藻蓝蛋白溶液在25℃下存放14 d后，色素保存率几乎为零，藻蓝蛋白几乎全部损失，加了添加剂的色素保存率比未加添加剂的高出16.1%。25℃和4℃下加了添加剂的藻蓝蛋白溶液的色素保存率明显高于未加添加剂的，这是由于3种添加剂复合起来对于藻蓝蛋白有很好的护色、防腐作用。因此，藻蓝蛋白适宜在低温条件下加添加剂储存。

3 结论

温度、日光光照和pH值的不同都会影响藻蓝蛋白的储存稳定性，其中，温度对于藻蓝蛋白的稳定性影响最明显，日光光照对于藻蓝蛋白的稳定性影响较小。

适当浓度的山梨糖醇、葡萄糖和氯化钠对藻蓝蛋白起到明显的护色、防腐作用，并且不影响其性质。本试验选用3种添加剂复合加入藻蓝蛋白水溶液中，研究得出其对于藻蓝蛋白色素的储存稳定性有明显的改善作用。添加了复合添加剂的藻蓝蛋白可以广泛应用于食品、化妆品等领域中，具有很高的应用价值。

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The Research of the Storage Stability of Phycocyanin from Spirulina Platensis

XU Run，CHEN Ye*，SUN Ping
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The influence of temperature，daily light，pH value and different additives on stability of phycocyanin were studied.The results showed that phycocyanin should be stored under 40℃in dark place；and it was appropriate to be stored under neutral condition；glucose，sodium chloride and sorbitol could improve the stability of phycocyanin.Phycocyanin with preservatives consist of glucose，sodium chloride and sorbitol stored in daily temperature for 72 h made the pigment remain ratio of phycocyanin increased from 50.90%to 78.10%，67.02%and 69.08%；the pigment remain ratio of phycocyanin with composite of glucose，sodium chloride and sorbitol in proportion of 1∶1∶0.3（mass ratio）stored in 4℃for 14 days was 54.4%higher than pured phycocyanin's；the pigment remain ratio of phycocyanin with additives stored in 25℃was 16.1%higher than pured phycocyanin's.

phycocyanin；additives；stability；composite

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.007

2016-09-11

徐润（1992—），女（汉），硕士研究生在读，研究方向：农产品加工与保鲜。

*通信作者