复合菌-荔枝多酚对小鼠抗腹泻效果及抗氧化性的影响

张军丽,涂 杜,彭新宇,徐志宏,*

(1.华中农业大学,湖北武汉 430070;2.广东省农业科学院动物卫生研究所,广东广州 510640)



复合菌-荔枝多酚对小鼠抗腹泻效果及抗氧化性的影响

张军丽1,涂 杜2,彭新宇2,徐志宏2,*

(1.华中农业大学,湖北武汉 430070;2.广东省农业科学院动物卫生研究所,广东广州 510640)

为研究复合菌-荔枝多酚对小鼠抗腹泻效果、生长性能及抗氧化的影响,选用96只体重为18～22 g的SPF级昆明小鼠,随机分为8个处理组:正常组、模型组、阳性对照组、嗜酸乳杆菌组(Lactobacillusacidophilus)、丁酸梭菌组(Clostridiumbutyricum)、荔枝多酚组、复合菌组(Lactobacillusacidophilus和Clostridiumbutyricum)、复合菌-荔枝多酚组,实验周期为14 d。于实验第1～14 d分别进行预防性及治疗性给药(除正常组和模型组),定期测所有小鼠体重和采食量,实验第10 d利用蓖麻油灌胃法制备小鼠腹泻模型观察腹泻指标,实验第14 d,对各组小鼠血清的SOD和GSH-Px及CAT进行测定。结果表明:造模当天,模型组的体重变化最明显,腹泻最严重,复合菌-荔枝多酚组抑制小鼠的腹泻效果最好;抗氧化指标显示,复合菌组和荔枝多酚组SOD、GSH-Px及CAT含量均显著高于模型组(p<0.05),而复合菌-荔枝多酚组GSH-Px及CAT含量显著高于模型组(p<0.05)。本研究表明,对小鼠蓖麻油腹泻模型,复合菌-荔枝多酚表现出明显的抗腹泻和抗氧化效果。

复合菌-荔枝多酚,抗腹泻效果,生长性能,抗氧化性

腹泻是许多疾病的共有临床症状,严重危害人类健康,对儿童危害极大,是造成儿童营养不良和生长障碍的重要原因,也是造成畜禽幼仔死亡和生长缓慢的主要原因[1]。目前,临床上多用抗生素治疗腹泻,长期使用抗生素易产生抗药性以及药物残留,同时存在损害胃肠道等问题;益生菌(probiotics)是指含有活菌或死菌,包括菌体成分及代谢产物的生物制品。服用后可改善机体微生物与酶的平衡,通过动物消化道生物的竞争排斥作用,帮助动物建立有利于宿主的胃肠道微生物区系,具有刺激机体特异性与非特异性免疫、预防腹泻,促进生长,提高饲料利用率等优点[2]。随着人民生活水平和消费水平的提高,对农产品国际市场竞争压力的增加以及对滥用抗生素危害认识的深入,益生菌制剂受到越来越多的关注,其在饲料和功能食品领域必将具有十分广阔的发展空间[3]。因此寻找安全、高效、无残留的微生态制剂或植物源活性成分来替代抗生素成为研究的热点之一。

作为益生素家族中一员的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus),是动物肠道中的重要微生物[4]。因其无毒、无害,常被制成微生物添加剂,用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病[5]。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)又名酪酸菌,具有提供营养、促进代谢、维持人和动物肠道健康等作用,尤其对治疗由肠道菌群紊乱引起的炎症、急慢性腹泻、肠易激综合征等疾病效果显著[6]。荔枝多酚可以抗氧化,有效缓解机体损伤;抑菌消炎,抗病毒,提高机体的免疫力,可以预防疾病,预防癌症,抗肥胖[7]。荔枝多酚含有丰富的黄酮化合物,Dicarlo等研究发现一定量的黄酮类化合物能够通过α2-肾上腺素和钙系统抑制蓖麻油导致的腹泻和肠腔积液[8]。本实验拟建立小鼠蓖麻油致腹泻模型,模拟人和动物因环境(温度、湿度)变化,食物变化等应激反应导致的腹泻,研究复合菌-荔枝多酚对小鼠的抗腹泻、抗氧化作用以及生长性能的影响,探讨复合菌-荔枝多酚抗腹泻的生物学机制,为研制出高效、绿色、安全的新型抗腹泻复方制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级昆明种小鼠 雌雄各半,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2014-0004,小鼠雌雄分开,正压通风,空调调节温度,温度为(26±1) ℃,光照周期12 h明12 h暗,小鼠自由饮食与饮水,适应性饲养一周;嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus,GIMCC GIM1.730)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum,GIMCC GIM1.676) 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心;MRS培养基、梭菌增菌培养基 广东环凯微生物科技有限公司;荔枝多酚(荔枝皮提取) 纯度95%,由华中农业大学食品学院实验室提供;蓖麻油 湖北科田药业有限公司;洛哌丁胺 西安杨森制药有限公司;超氧化物歧化酶试剂盒(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(GSH-Px)、过氧化氢酶试剂盒(CAT) 南京建成生物工程研究所;其他试剂 均为国产分析纯。

UV-3100PC型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;XS-205DU型Metter-Toledo-xs十万分一天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;HH-2型数显恒温水浴锅 常州奥华仪器有限公司;ELX-800型全自动酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;Eppendorf-5804R型低温/高速离心机 德国Eppendorf公司;LRH-150F型系列生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 本实验选用96只体重为18～22 g的SPF级昆明小鼠,雌雄各半,随机分为8个处理组:正常组、阳性对照组、模型组、嗜酸乳杆菌组、丁酸梭菌组、荔枝多酚组、复合菌、复合菌-荔枝多酚组,实验周期为14 d。每天各组定时按10 mL/kg体重灌胃药物或无菌去离子水,正常饮食。每天上午8:00正常组、模型组给予无菌去离子水,阳性对照组按洛哌丁胺3 mg/kg浓度灌胃;荔枝多酚组按荔枝多酚300 mg/kg的浓度灌胃;嗜酸乳杆菌组灌胃浓度1010～1011cfu/mL的嗜酸乳杆菌培养液;丁酸梭菌组灌胃浓度105～106cfu/mL丁酸梭菌培养液;复合菌组按上述丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌菌液1∶1体积混合灌胃;复合菌-荔枝多酚组按上述丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌溶液1∶1体积混合灌胃。每天下午3:00复合菌-荔枝多酚组再按10 mL/kg的体重灌胃300 mg/kg的荔枝多酚,其他组灌胃等剂量的无菌去离子水。第10 d所有小鼠(除正常组)按每只0.5 mL灌胃蓖麻油建立腹泻模型,之后每天仍按10 d前的方式按时灌胃。第14 d摘眼球取血后,按照实验动物标准处死小鼠。

1.2.2 菌种培养 嗜酸乳杆菌活化后,接种量为5%于MRS培养基中,培养时间为12 h,丁酸梭菌活化后接种量为5%于梭菌增菌培养基中,培养时间为24 h,温度均为37 ℃。在上述培养条件下均达到稳定期,分别采用MRS培养基、梭菌增值培养基三次重复进行活菌计数,嗜酸乳杆菌近似可达1010～1011cfu/mL,丁酸梭菌近似可达105～106cfu/mL。按时培养后直接灌胃小鼠。

1.2.3 生长性能测定 实验第1、5、9、10、14 d定时(08:00)及第10 d下午3:00称量小鼠体重,并计算各处理组小鼠采食量,平均采食量及平均体重。采食量=饲料投放量-第2 d 饲料剩余量;平均采食量=12只小鼠总采食量/12;平均体重=12只小鼠总体重/12。

1.2.4 腹泻指标的测定 实验第10 d,除正常组外,其它组均灌胃蓖麻油后8组全部禁食4 h。每只小鼠灌胃0.5 mL蓖麻油后放入铺有滤纸的鼠笼内,每笼一只,观察小鼠腹泻情况后放入原来的笼子继续喂养。(小鼠大便大致分为5种:正常便;外形正常,但含水多便;外形不正常的软便;水样便;黏液便),前2种为正常便,后3种视为腹泻便。统计小鼠灌服蓖麻油4 h内的开始腹泻时间、腹泻次数、稀便重量、并计算稀便率以及腹泻抑制率[9]:

表1 复合菌-荔枝多酚对小鼠体重的影响Table 1 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the body weight of mice

注:同列肩注无字母表示均值间差异不显著(p>0.05)。开始腹泻时间(min)=第一次腹泻时间-灌胃时间;

稀便重量=腹泻后滤纸重量-滤纸前重量-正常粪便量;

稀便率(%)=(每只小鼠稀便数/每只小鼠总便数)×100;

腹泻抑制率(%)=(模型组腹泻次数-处理组腹泻次数)/模型组的腹泻次数×100。

1.2.5 检测指标及方法 小鼠摘眼球采血静置后,血样4000 r/min离心5 min分离血清于-20 ℃保存待测。采用试剂盒法测定各组小鼠血清的SOD、GSH-PX、CAT值,具体操作参照试剂盒说明书进行。

1.3 数据处理

所有实验数据均使用SPSS 17.0统计软件进行分析计量资料采用平均数±标准差表示,多组间平均数比较采用单因素方差分析法,两两比较采用Duncan多重比较法。

2 结果与分析

2.1 体重与采食量

由表1可见,造模前后其它各组与模型组比较,小鼠体重均无显著性差异(p>0.05)。Stanton等研究表明,益生菌能直接产生氨基酸、维生素等营养物质,补充机体营养成分,促进畜禽生长[10]。复合菌组、嗜酸乳杆菌组、丁酸梭菌组均未表现出促增长的作用,可能是喂养小鼠时间还不够长。而荔枝多酚组和益生菌-荔枝多酚组均与模型组比较差异不显著是由于摄入一定量的荔枝多酚具有抗肥胖的作用,与Qi等研究报道一致[11]。由图1可见,模型组第10 d造模前后体重变化幅度较大,其它各组均与模型组差异显著(p<0.05),表明给药组所受蓖麻油腹泻影响较小,具有抵抗腹泻的作用。

图1 复合菌-荔枝多酚对小鼠第10 d体重变化的影响Fig.1 The effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the weight change of mice at the 10th day注:1:正常组;2:模型组;3:阳性对照组;4:嗜酸乳杆菌组;5:丁酸梭菌组;6:荔枝多酚组;7:复合菌组;8:复合菌-荔枝多酚组;不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

由图2可见,由于造模当天(第10 d)正常组无腹泻处理,饮食正常,其他组受腹泻的影响饮食量减少,从而采食量与模型组差异显著(p<0.05),其他时间的采食量各组之间并无差异显著性。

图2 复合菌-荔枝多酚对模型小鼠采食量的影响Fig.2 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the feed intake of mice

2.2 腹泻指标

由表2可见,造模当天阳性对照组、荔枝多酚组、复合菌组、复合菌-荔枝多酚组的开始腹泻时间、稀便重量、腹泻平均次数、稀便率均与模型组差异显著(p<0.05),嗜酸乳杆菌组开始腹泻时间、腹泻平均次数与模型组差异显著(p<0.05),并且复合菌-荔枝多酚组腹泻抑制率是各组中最高的,达到36%,说明小鼠蓖麻油致腹泻模型建立成功。荔枝多酚组、复合菌组和复合菌-荔枝多酚组均具有显著的抗腹泻效果,主要是荔枝多酚能抑制脂肪酶活性导致蓖麻油在十二脂肠内受脂肪分解酶的这一过程受到阻碍,从而达到抗腹泻的效果。荔枝皮提取的多酚中含有6种独立存在的多酚:没食子酸、绿原酸、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素和芦丁[12],还含有黄酮化合物(槲皮素和山柰酚)和糖苷类物质[13]。槲皮素、芦丁、儿茶素、山柰酚既属于多元酚又属于黄酮类化合物,而多元酚和蛋白具有亲和力,与脂肪酶有聚集效应,从而使多元酚能够抑制脂肪酶的活性[14]。嗜酸乳杆菌组能延迟腹泻,减轻腹泻次数。主要是当其达到一定数量时,能够抑制病原微生物在宿主肠道中的存活和生长,起到屏障作用;消除乳糖不耐症;减轻和抑制肠道腹泻;增强机体免疫功能;降低胆固醇水平等[15]。由于荔枝多酚和嗜酸乳杆菌的双重抗腹泻效果,其中复合菌-荔枝多酚组的腹泻抑制效果最好,该研究结果表明,荔枝多酚、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌复合比单独使用效果更好,具有协同作用。

表2 复合菌-荔枝多酚对小鼠腹泻的影响Table 2 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the diarrhea of mice

注:同列相同字母表示差异不显著(p>0.05);同列不同字母表示差异显著(p<0.05),表3同。

表3 益生菌-荔枝多酚对小鼠血清SOD、GSH-PX、CAT的影响Table 3 Effects of compound probiotics-litchi polyphenol on the SOD,GSH-PX,CAT of mice serum

2.3 对小鼠血清SOD、GSH-PX、CAT的影响

由表3可知,荔枝多酚组、复合菌组与模型组的SOD、GSH-PX、CAT均差异显著。表明荔枝多酚、复合菌能够显著提高腹泻后小鼠的抗氧化性。研究发现荔枝皮中富含荔枝多酚,并且在DPPH和FRAP实验中荔枝皮中的自由酚和结合酚有明显的抗氧化效果[12]。在过去十年中,一些研究者认为益生菌能够减少氧化应激,例如嗜酸乳杆菌和双歧杆菌[16]。也有人报道出嗜酸乳杆菌除了防止氧化应激和还可以降低自由基的积累[17]。与本研究结果相一致,测定中嗜酸乳杆菌组GSH-PX和CAT指标与模型组比较差异显著(p<0.05),荔枝多酚组、复合菌组抗氧化指标与模型组比较均差异显著(p<0.05)。国外研究发现,饲粮中添加丁酸梭菌能够提高肉鸡血清抗氧化能力并增强机体免疫功能,促进蛋白质代谢,进而改善肉鸡的生长性能[18]。本实验中丁酸梭菌并没有提高蓖麻油致泻后小鼠的抗氧化水平,具体原因尚不清楚。复合菌-荔枝多酚组与模型组GSH-PX、CAT值差异显著,SOD值差异不显著,可能是丁酸梭菌影响了整体的抗氧化性。

3 结论

由嗜酸乳杆菌、丁酸梭菌和荔枝多酚联用,对小鼠的生长性没有促进作用,而在抗腹泻和抗氧化方面,复合菌-荔枝多酚对小鼠蓖麻油腹泻模型体现出明显的抗腹泻、抗氧化效果,对于其它腹泻模型是否具有同样的效果仍需进一步探究。

[1]Fairbrother J M,Nadeau E,Gyles C L.Escherichiacoliin postweaning diarrhea in pigs:An update on bacterial types,pathogenesis and prevention strate-gies[J]. Anita Health Res Rev,2006(1):17-39.

[2]郭本恒.益生菌[M].北京:化学工业出版社,2004:1-2.

[3]叶红玲,刘东,叶明,等.复合益生菌对昆明小鼠生长性能和肠道酶活性的影响[J].安徽农业科学,2016,44(19):173-175.

[4]赵瑞香,李元瑞,罗磊.嗜酸乳杆菌生产特性的研究[J].西北农林科技大学学报,2002,30(3):85-88.

[5]田芬,陈俊亮,粘靖祺.嗜酸乳杆菌和双歧杆菌益生特性的研究[J].食品工业科技,2012,33(7):85-88.

[6]易中华,敖清根.饲用酪酸菌制剂的研发及其在动物生产中的应用[J].湖南饲料,2013(5):22-24.

[7]Ibrahim S M,Mohamed G A. Litchi chinensis:medicinal uses,phytochemistry and pharmacology[J]. Ethnopharmacolog,2015(174):412-513.

[8]Dicarlo G,Autore G,Izzo A. Inhibition of intestinal motility and secretion by flavonoids in mice and in rats:structural activity relationship[J]. Pharm Pharmacol,1993,45:1054-1059.

[9]Bellon F H,Maiha B B,Anuka J A.The effect of methanol rhizome extract of Nymphaea lotus Linn(Nymphaeaceae)in animal models of diarrhoea[J].Ethnopharmacology,2016(190):13-21.

[10]Stanton C,Ross P R,Fttzgerald F G,et al.Fermented functional foods based on probiotics and their biogenic metabolites[J]. Current opinion in biotechnology,2005,16(2):198-203.

[11]Qi S,Huang H,Huang J,et al.Lychee(Litchi chinensis sonn)seed water extract as potential antioxidant and anti-obese natural additive in meat products[J]. Food Control,2015,50:195-201.

[12]Zhang R,Zeng Q,Deng Y,et al.Phenolic profiles and antioxidant activity of litchi pulp of different cultivars cultivated in southern china[J].Food Chem,2013,136:1169-1176.

[13]Mahattanatawee K,Manthey J A,Luzio G,et al. Total antioxidant antioxidant activity and fiber content of select Florida-grown tropical fruits[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(19):7355-7363.

[14]Birari R B,Bhutani K K. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources:Unexplo red potential[J].Drug Discovery Today,2007,12:879-889.

[15]瑞哲.酸乳杆菌作用机理的研究进展[J].中国科技信息,2006(2):58-59.

[16]Amaretti A,di Nunzio M,Pompei A,et al. Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria:invitroandinvivoactivities[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(2):809-817.

[17]Virtanen T,Pihlanto A,Akkanen S,et al. Development of antioxidant activity in milk When during fermentation with lactic acid bacteria[J]. Hppl Microbid,2007,102:106-115.

[18]Liao X D,Ma G,Cai J,et al.Effects of Clostridium butyricum on growth Performanc,antioxidation and immune function of broilers[J]. Poult Sci,2015,94(4):662-667.

The effect of compound probiotics-litchi polyphenol on antidiarrhea and antioxidation of mice

ZHANG Jun-li1,TU Du2,PENG Xin-yu2,XU Zhi-hong2,*

(1.Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Institute of Animal Health,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,China)

Ninety-six SPF Kunming mice with 18～22 g body weight were randomly divided into 8 groups to investigate the effect of compound probiotics-litchi polyphenol on antidiarrhea,growth performance and antioxidation of mice. Health group,model group,positive control group,Lactobacillusacidophilusgroup,Clostridiumbutyricumgroup,litchi polyphenol group,compound probiotics(LactobacillusacidophilusandClostridiumbutyricum)group,compound probiotics-litchi polyphenol group were included in present study. From the 1th to 14th day of the experimental period,the mice were administered for prevention and therapy purpose except for health group and model group,all weight and feed intake were measured regularly. At the 10th day,the diarrhea model in mice was prepared by intragastrical administration of castor oil.At the 14th day,the serum SOD,GSH-Px and CAT were assessed.Results showed that,weight change and diarrhea of model group were most obvious at the 10 th day.The diarrhea inhibition effect of compound probiotics-litchi polyphenol group was best. Antioxidant indexes suggest that compound probiotics group and litchi polyphenol group were significantly higher than that of model group on SOD,GSH-Px and CAT(p<0.05),compound probiotics-litchi polyphenol with the model group had higher difference on GSH-Px and CAT(p<0.05).It is demonstrated that the compound probiotics-litchi polyphenol have obvious antidiarrhea and antioxidant effect in the castor oil diarrhea mice model.

compound probiotics-litchi polyphenol;antidiarrhea effect;growth performance;antioxidation

2016-11-28

张军丽(1990-),女,在读硕士研究生，研究方向:食品化学,E-mail:1741318250@qq.com。

*通讯作者:徐志宏(1965-),男,硕士，研究员,研究方向:营养,E-mail:545976530@qq.com。

广东省科技计划项目(2015A020209080);广州市科技计划项目(201604020138)。

TS255.3

A

1002-0306(2017)10-0364-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.062