酶解辅助高压均质制备纳米纤维素及其性质表征

向亚美,王文涛,董海洲,侯汉学，张锦丽

(山东农业大学,山东泰安 271018)



酶解辅助高压均质制备纳米纤维素及其性质表征

向亚美,王文涛,董海洲,侯汉学，张锦丽*

(山东农业大学,山东泰安 271018)

本研究以微晶纤维素为原料,经过超微粉碎预处理后,通过酶解辅助高压均质的方法制备纳米纤维素,研究纳米纤维素的结构和理化性质,并通过扫描电镜、透射电镜、红外光谱、X-射线衍射和热失重分析对纳米纤维素进行表征。结果表明,超微粉碎前处理能使微晶纤维素颗粒大小形状趋于均一化;所制备的纳米纤维素呈束状结构,颗粒直径为15～40 nm;纳米纤维素在制备过程中纤维素结构未遭到破坏;纳米纤维素的结晶度为58.1%,仍属于纤维素Ⅰ型;纳米纤维素的起始热分解温度比微晶纤维素的分解温度低,当温度达到500 ℃时,纳米纤维素的热失重率为82.9%。因此通过酶解辅助高压均质制备的纳米纤维素有望在可降解复合材料中得到应用。

纳米纤维素,微晶纤维素,酶解,高压均质

纳米纤维素是以富含纤维素的生物质材料为原料,通过去除半纤维素、木质素等非纤维成分,并采用机械的、化学的或生物的方法将其任一维尺寸缩减至100 nm以内的纤维素材料[1]。纳米纤维素的直径通常为5～100 nm,长度在几十到数百纳米之间,具有较高的长径比[2]。与普通纤维素材料相比,纳米纤维素还具有高比表面积、高强度、高结晶度等特点,因而被广泛应用于高分子材料的增强材料[3]。

由于纤维素分子内和分子间存在极强的氢键作用,因此,从天然纤维素中提取出纳米尺寸且具有高稳定性的纤维素晶体,一直是纤维素加工领域中需要突破的难题。目前,制备纳米纤维素的主要方法包括化学法和机械法。其中化学法主要采用强酸水解法,其产品通常被称为纳米微晶纤维素[4];机械法主要包括胶体磨强剪切、球磨、超声波或高压均质,产品称为纤维素纳米纤维[5]。为了提高纳米纤维素的制备效率,国内外学者探索了多种纤维素材料的预处理方法,如化学改性、溶剂处理和酶解等方法[6]。

酶水解法制备纳米纤维素,工艺条件温和、专一性强、环境友好,但产率较低。高压均质法可以比较容易地放大至工业化连续生产,但其能耗偏大,而且植物纤维中的长纤维经常会引起设备内部特别是活动部件如阀门处的堵塞,必须拆卸清洗,进而影响生产效率。因此,采用酶解辅助高压均质的方法来制备纳米纤维素可以有效的弥补两种方法的缺陷[7-8]。Henriksson等[7]研究发现,用纤维素内切酶水解云杉木浆可以促进后续高压均质过程中纤维素的崩解。这种方法制备的纳米纤维素具有更高的分子量和更大的长径比。Pääkkö等[8]用纤维素内切酶水解云杉和松树混合木浆,然后进行高压均质,实现了木质纤维的可控纳米化工艺。本研究以微晶纤维素为原料,采用工业上广泛使用、价格相对低廉的纤维素酶进行酶解,然后高压均质处理制备纳米纤维素,并通过扫描电镜、透射电镜、红外光谱、X-射线衍射和热失重分析对纳米纤维素进行表征分析,为进一步研究纳米纤维素的性能与应用提供基础数据与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

微晶纤维素 平均粒径45 μm左右,湖州市菱湖新望化学有限公司;纤维素酶 酶活为434320 U/g,泰安信得利生物工程有限公司;柠檬酸、磷酸氢二钠 分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司。

ZKY-303S型超微粉碎机 北京中科浩宇科技发展有限公司;SHA-BA水浴恒温振荡器 常州润华电器有限公司;AY220电子分析天平 日本岛津公司;HH-2数显恒温水浴锅 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司;Scientz-150高压均质机 宁波新芝生物科技股份有限公司;KYKY-2800B型扫描电子显微镜 中科院北京中科科仪公司;Scientz-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Tecnai20U-TWIN透射电镜 荷兰飞利浦公司;Zetasizer Nano ZS纳米粒度仪 英国马尔文仪器有限公司;D8 ADVANCE型X-射线衍射仪 德国BRUKER-AXS有限公司;Nexus 670傅立叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;TA-60热重分析仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微晶纤维素的前处理 取500 g烘至绝干的微晶纤维素倒入超微粉碎机中粉碎,分别设置主机转速、风机转速为1600、2000 r/min,粉碎后的微晶纤维素过200目筛后备用。

1.2.2 纳米纤维素的制备

1.2.2.1 酶解法制备纳米纤维素 准确称取3.00 g超微粉碎后的微晶纤维素倒入250 mL锥形瓶中,加入90 mL pH为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和1500 U/g的纤维素酶溶液,将锥形瓶放入恒温水浴振荡锅中在50 ℃酶解24 h,反应结束后在80 ℃水浴中灭活30 min终止反应。采用高速离心机10000 r/min离心10 min,加入去离子水反复多次离心洗涤得到上层的纳米纤维素胶体溶液,将其置于冷冻干燥机中,冷冻干燥48 h得到纳米纤维素产物。

1.2.2.2 高压均质制备纳米纤维素 准确称取3.00 g超微粉碎后的微晶纤维素用去离子水配制成1%溶液,在800 bar的压力下高压均质6次,得到纤维素悬浮液。将悬浮液用高速离心机10000 r/min离心10 min,加入去离子水反复多次离心洗涤得到上层的纳米纤维素胶体溶液,将其置于冷冻干燥机中,冷冻干燥48 h得到纳米纤维素产物。

1.2.2.3 酶解辅助高压均质制备纳米纤维素 按照1.2.2.1操作,然后向酶解反应后的纤维素水溶液中加入一定量的去离子水,调整水解液的浓度1%,再按1.2.2.2操作。

1.2.3 纳米纤维素产率计算 测量纳米纤维素胶体溶液的总质量,用移液管吸取20 mL纳米纤维素胶体溶液于已称量过的量瓶中,冷冻干燥至恒重,取出放入干燥器内30 min使其达到室温,然后在电子天平上称重。

式中:m1为干燥后样品与称量瓶的质量(g);m2为称量瓶的质量(g);m3为原料的质量(g);V1为纳米纤维素胶体溶液的总体积(mL);V2为移液管吸取纳米纤维素的体积(mL)。

1.2.4 扫描电镜(SEM)分析 采用扫描电子显微镜观察样品的形貌。取少量粉末样品使用导电胶带置于扫描电镜载物台上,在观察之前,利用喷金仪对样品喷金40 s,喷金电流为10 mA。完成喷金后,置于扫描电镜中观察样品,加速电压为3.0 kV。

1.2.5 透射电镜(TEM)分析 用去离子水将纳米纤维素配成1%悬浮液(w/w),超声分散5 min,用移液枪吸取适量样液滴在铜网上,室温下晾干,用透射电镜观察其微观形态和粒径大小,加速电压为100 kV。

1.2.6 纳米纤维素粒径分析 用去离子水将纳米纤维素配成1%悬浮液(w/w),用纳米粒度仪测定粒子的平均粒径,对每一个样品扫描12次,取平均值。

1.2.7 红外光谱(FT-IR)分析 取少量冷冻干燥后纳米纤维素在研钵中研磨后,通过红外分析仪对样品进行红外光谱分析,测量的波长范围为500～4500 cm-1,分辨率为4 cm-1,累计扫描32次。

1.2.8 X-射线衍射(XRD)分析 采用X-射线衍射测定纤维素样品的结晶度和晶型,取适量冷冻干燥后的样品,放入X-射线衍射样品池内,样品测试2θ角范围为5～40°,测试速率为0.02°/s。结晶度测试按下式计算[9]:

其中:CrI为结晶度;I002为2θ=22.8°衍射峰强度;Iam为2θ=18°衍射峰强度。

1.2.9 热失重分析 通过热重分析仪对样品进行热失重分析,实验中选取的测试温度范围25～500 ℃,升温速率25 ℃/min,气体环境N2,气流速度50 mL/min。

1.3 数据处理

数据采用Origin8.0,SPSS 18.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜分析

图1为微晶纤维超微粉碎前后的扫描电镜图。从图1(a)中可以看出微晶纤维素的形状多样,有柱状、球状及不规则形状等,颗粒大小不均匀,且有较多大颗粒出现。图1(b)经过超微粉碎后,微晶纤维素的粒径变小,形状和颗粒大小也趋于均一化,说明经过超微粉碎的高速研磨可以降低微晶纤维素的粒径,并使其均一化,从而有利于后续的纳米纤维素的制备。

图1 微晶纤维素的扫描电镜图Fig.1 SEM images of microcrystalline cellulose注:(a)微晶纤维素(200×);(b)超微粉碎微晶纤维素(200×)。

2.2 不同制备方法对纳米纤维素产率的影响

表1为采用不同的方法制备纳米纤维素的产率。从表1可以看出,酶解辅助高压均质的方法制备的纳米纤维素产率最高,达到38.36%。由于纤维素酶只能水解纤维材料的无定形区,而对结晶区的作用非常缓慢[10],因此在相同的制备条件下,酶解方法制备纳米纤维素得率最低。高压均质6次,每一次都能促进纤维材料的崩解,并释放出一定的纳米纤维素,因而纤维素的得率相对较高。但是,由于纤维素纤维的长度较大,单独使用高压均质,容易造成高压均质机的堵塞,需要拆卸清洗,制备效率较低。酶解辅助高压均质制备纳米纤维素过程中,纤维素酶能够水解纤维材料的无定形区,从而降低原料纤维素的长度,增加细小纤维素的含量,有利于纤维结晶的崩解形成纳米纤维素。而且酶解处理使纤维素在均质的过程中不易堵塞均质机,并降低能量消耗,这些因素都使纤维素更加容易崩解,使纳米纤维素的产率得到提高。Henriksson等[7]的研究结果也表明,对机械撞击的纤维材料进行酶解预处理能够显著促进高压均质后纳米纤维素从纤维材料基质中的剥离。

表1 不同制备方法对纳米纤维素产率的影响Table 1 Effect of different preparation methods on the yield of cellulose nanocrystals

2.3 纳米纤维素形态分析

纳米纤维素的形态是影响其应用性能的重要因素之一,它受到纤维素来源和制备方法的影响。由图2(a)、图2(c)可知,酶解辅助高压均质制备出的纳米纤维素呈束状结构,束状结构样品最小直径可达到5 nm,平均直径在15～40 nm之间,长度在100～900 nm之间。从图2(b)和图2(c)中可以看出纳米纤维素存在部分团聚,这可能是纳米纤维素比表面积大,表面含有大量的羟基,容易形成氢键,氢键相互作用从而容易产生团聚[11]。

图2 纳米纤维素形态图Fig.2 Morphology images of cellulose nanocrystals

2.4 纳米纤维素粒径分析

从图3可以看出,通过酶解辅助高压均质处理能够让纤维束中的单根纤维分离出来,从而使它们的直径减小到纳米级范围,表明通过该方法能够制备出达到纳米级别的纤维素。另外,从图3可知,纳米纤维素纤维的粒径大约在几纳米到80 nm之间,并且大部分的纳米纤维素纤维的粒径都在15～40 nm之间,此研究结果与Li制备的桑皮纳米纤维素(20～40 nm)相似[12],然而与Ahmed制备的牛角瓜种子纳米纤维素(14～24 nm)存在差异[13],这主要是因为不同原料和制备方法制备出来的纳米纤维素颗粒大小不同,因此不同的研究中会存在部分差异[14]。

图3 纳米纤维素的粒径分布图Fig.3 Particle size distribution of cellulose nanocrystals

2.5 红外光谱分析

图4为微晶纤维素和纳米纤维素的红外光谱图。从图4可以看出,微晶纤维素和纳米纤维的红外光谱图的吸收波带基本相同,吸收强度及吸收带位置略有变化,表明酶解辅助高压均质处理后其形态结构有一定的差异,但纳米纤维素粒子仍然具有纤维素的基本化学结构。微晶纤维素和纳米纤维素都在3340 cm-1附近有较强较宽的羟基的吸收峰,属于-OH的伸缩振动[15],比较二者的吸收带,纳米纤维素的-OH的伸缩振动谱带较微晶纤维素的稍微变窄,这主要是由于制备过程中破坏了纤维素分子内的氢键。2899 cm-1附近属于-CH2的C-H的对称伸缩振动[16];1630～1650 cm-1出现的小的吸收峰由纤维素吸附的水造成,这主要是由于纤维素结构中具有大量羟基,有较强的吸水性[17];图4中均存在1059 cm-1和896 cm-1两个吸收峰,分别归属于纤维素分子的C-O伸缩振动峰和C-H摇摆振动吸收峰[18]。

图4 微晶纤维素(a)和纳米纤维素(b)的红外光谱图Fig.4 Fourier transform infrared spectra of microcrystalline cellulose(a)and cellulose nanocrystals(b)

2.6 X-射线衍射(XRD)分析

图5为微晶纤维素和纳米纤维素的XRD曲线。从图5可以看出微晶纤维素和纳米纤维素的衍射峰位置基本一致,在2θ=15.6°、22.3°和34.4°均出现衍射峰,且在22.3°处的主衍射峰未出现双峰,证明为纤维素典型的I型结晶结构[19]。说明制备纳米纤维素过程中纤维素的主要晶型没有受到破坏,纳米纤维素保持原来的晶型。

图5 微晶纤维素(a)和纳米纤维素(b)的X-射线衍射图Fig.5 X-ray diffraction patterns of microcrystalline cellulose(a)and cellulose nanocrystals(b)

通过X-射线衍射可以计算出微晶纤维素和纳米纤维素的结晶度分别为59.7%和58.1%。纳米纤维素的结晶度较微晶纤维素的略低,本文的结果与吴开丽[20]等研究结果相同。这主要是由于纳米纤维素颗粒的粒径很小、比表面积大,高压均质处理使得纳米纤维素表面产生疏松的无定形区,因此相较于微晶纤维素结晶度略微降低。这一结果也可以从纳米纤维素透射电镜图(图2b)上直观看出。

2.7 热失重分析

图6 微晶纤维素(a)和纳米纤维素(b)的TG曲线Fig.6 TG curves of microcrystalline cellulose(a) and cellulose nanocrystals(b)

热失重曲线表征的是样品的热稳定性,图6、图7分别是微晶纤维素和纳米纤维素的TG和DTG曲线。从图6可以看出,在100 ℃左右两种样品均出现了轻微的热失重现象,这是由于纤维素样品中残留的水分蒸发或纤维素提取过程中残留小分子挥发造成的[21]。从TG和DTG图中还可以看出,在200 ℃以后,微晶纤维素和纳米纤维素的热失重开始出现明显的差异,微晶纤维素在300～385 ℃区域内迅速分解,热失重率大于90%,当温度达到500 ℃时,微晶纤维素的热失重率为94.57%;纳米纤维素的热分解从205 ℃开始一直持续到373 ℃,热失重率为80%,当温度达到500 ℃时,热失重率为82.9%,说明纳米纤维的热降解温度比微晶纤维素的低。这可能是由于以下两个方面引起的:一方面由于微晶纤维素经酶解均质后,粒径和聚合度均降低,比表面积增加,外露的反应活性基团和表面上的末端碳比例明显提高,从而导致其热稳定性下降;另一方面在酶解均质过程中,颗粒的减小导致大量的纤维素链段被破坏断裂,使得产物的表面存在着许多纤维素分子链的断裂点以及低分子量的链段,这些链段排列不紧凑且不整齐,从而成为缺陷点。这些原因使得纳米纤维素在较低的温度下就开始吸热分解,从而使其热稳定性降低[22]。从DTG曲线中还可以看出,在最大的热失重速率处,纳米纤维素的热失重速率较微晶纤维素的低。另外,从TG曲线可以看出纳米纤维素的热分解残余率明显较大,表明微晶纤维素经水解降解形成纳米纤维素后,热分解成碳量较微晶纤维素增加[23]。

图7 微晶纤维素(a)和纳米纤维素(b)的DTG曲线Fig.7 DTG curves of microcrystalline cellulose(a) and cellulose nanocrystals(b)

3 结论

3.1 通过超微粉碎处理可以减少微晶纤维素中的大颗粒,使颗粒趋于均一化,有利于后续纳米纤维素的制备。

3.2 通过对纳米纤维素进行相关表征分析,得到的纳米纤维素为束状结构,直径为15～40 nm,达到所要求的纳米尺寸;X-射线衍射分析得到其为典型的纤维素Ⅰ晶型,结晶度为58.1%;红外分析中,酶解均质并未改变纤维素的结构,反应过程中未发生衍生化反应;通过热重分析可知,纳米纤维素的起始的热分解温度为205 ℃,比微晶纤维素的热稳定性低,在500 ℃的热失重率为82.9%,低于微晶纤维素的热失重率。

3.3 根据以上分析以微晶纤维素为原料,采用酶解辅助高压均质的方法能够高效的制备纳米纤维素。

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Preparation and characterization of cellulose nanocrystals by enzymatic hydrolysis combined high-pressure homogenization

XIANG Ya-mei,WANG Wen-tao,DONG Hai-zhou,HOU Han-xue,ZHANG Jin-li*

(College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

In this study,cellulose nanocrystals were prepared from microcrystalline cellulose.It used enzymatic hydrolysis and high-pressure homogenization to process cellulose nanocrystals which was firstly pretreated by ultrafine grinding. Besides,the structure and physico-chemical properties of cellulose nanocrystals was investigated. The obtained cellulose nanocrystals were characterized by scanning electron microscopy,transmission electron microscopy,Fourier transform infrared spectroscopy,X-ray diffraction,and thermo gravimetric analysis. The results showed that ultrafine grinding made its particles and shape tend to uniform and did not change the property of the microcrystalline cellulose. The nanocrystals were rod-shaped,with a diameter ranging from 15 to 40 nm. During the preparation of cellulose nanocrystals,the cellulose structure had not been destroyed. The molecular cellulose type I crystalline structure remained intact while the crystallinity was 58.1%. The initial decomposition temperature of cellulose nanocrystals was lower than microcrystalline cellulose.The lost weight of cellulose nanocrystals was 82.9% when the temperature reached 500 ℃.The cellulose nanocrystals that prepared from enzymatic hydrolysis and high-pressure homogenization have potential application in biodegradable composites.

cellulose nanocrystals;microcrystalline cellulose;enzymatic hydrolysis;high-pressure homogenization

2016-10-14

向亚美(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程，E-mail：1090112835@qq.com。

*通讯作者:张锦丽(1974-)，女，博士，副教授，研究方向:生物技术，E-mail:zhangli@sina.com。

国家科技支撑技术课题(2015BAD16B05-03)；山东省重大应用技术创新项目。

TS201.1

A

1002-0306(2017)10-0076-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.007