SSR标记技术在“紫甘1号”紫甘蓝杂交种纯度鉴定中的应用

苗素平

(阳泉师范高等专科学校 基础部，山西 阳泉 045000)



·农业科学·

SSR标记技术在“紫甘1号”紫甘蓝杂交种纯度鉴定中的应用

苗素平

(阳泉师范高等专科学校 基础部，山西 阳泉 045000)

本研究以“紫甘1号”杂种一代及其亲本为材料，以CTAB法提取子叶DNA，运用SSR分子标记方法对种子纯度进行鉴定，并与田间纯度鉴定结果进行比较。实验结果表明，引物Bo-005在“紫甘1号”及其亲本间具有多态性，该标记鉴定200株杂种一代，种子纯度为98%，与田间鉴定结果完全一致，可以应用于“紫甘1号”的杂交种纯度鉴定。

“紫甘1号”；杂交种纯度；SSR分子标记

“紫甘蓝”(Brassica oleracea L.)又称红甘蓝、紫包菜，是十字花科芸薹属甘蓝种中的一个变种，为二年生植物，较喜冷凉气候。紫甘蓝中含有大量的S、Fe等矿质元素及维生素C、维生素E等维生素，尤其富含花青素苷，经常食用对人体大有裨益。“紫甘1号”是作者于2013年选育而成的紫甘蓝杂交一代品种，该品种具有叶球紧实、色泽紫红、耐储运、耐裂球、耐热、较抗病毒病和黑腐病等特性，受到了广大菜农的欢迎。近两年，随着种植面积的不断增加，用种量成倍扩大，导致种子质量控制难度加大，尤其是种子纯度。近年来，因种子纯度不够而导致的产量和品质下降，甚至纠纷事件在种子行业屡见不鲜，因此，建立一套快速、准确、稳定的“紫甘1号”杂交种纯度鉴定方法迫在眉睫。

杂交种纯度鉴定最常用的方法是田间种植鉴定，该方法虽简单直观，但耗时、费工、易受环境影响，难以满足大规模种子纯度鉴定的要求。SSR分子标记技术是近年来发展起来的一种以简单重复序列为基础的高效遗传标记，因其以基因组为鉴定对象，不受时空限制，所以大大节省了鉴定时间和成本，同时它具有多态性高、重复性好、易操作及共显性等优点，已越来越多地被应用到杂交种的纯度鉴定。李梅等[1]用 SSR 技术对‘圆梦’苦瓜商品种进行鉴定，纯度均达到标准要求；鲁忠富等[2]利用 SSR 技术建立了浙蒲 2 号、浙蒲 6 号等 5 个浙江主栽品种的指纹图谱纹，可高效鉴别瓠瓜种子真伪及纯度；张小康等[3]利用SSR技术对汉青一代萝卜进行鉴定，杂交种纯度为95.1%；姜陆等[4]利用SSR技术建立了甜瓜“西州蜜 17 号”种子的快速鉴定方法，纯度达98%。本研究以“紫甘1号”杂种一代及其亲本为材料，利用SSR分子标记对种子纯度进行鉴定，并与田间纯度鉴定结果进行比较，以期为“紫甘1号”建立高效的种子纯度鉴定方法，为保证其种子质量安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

“紫甘1号”杂种一代及其父、母本材料均由课题组提供，采用穴盘进行育苗，3-4片叶龄时采样，用液氮冷冻后放入超低温冰箱保存备用。SSR引物、PCR扩增试剂盒均购自上海生工生物工程技术有限公司。

1.2 实验仪器

RapidHIT200型NDA快速检测仪(美国IntegenX公司)、2720型PCR扩增仪(美国ABI 公司)、MG8600凝胶电泳成像系统(美国Thmorgan公司)、DYY-6C型全自动三恒多用电泳仪 (北京市六一仪器厂)、DYCZ-28C型垂直电泳槽 (北京市六一仪器厂)、Allegra X-15R型高速冷冻离心机(美国Beckman公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取方法 于3-4片叶龄时采样，“紫甘1号”200株，父本、母本各随机抽取20株，DNA提取采用改良的CTAB法。

1.3.2 SSR多态性引物的筛选 30对SSR引物序列信息来源于Li等[5]公开发表的文献，由上海生工生物工程技术有限公司合成。多态性引物的筛选分别以“紫甘1号”的父本和母本DNA为模板进行PCR扩增，通过电泳检测筛选出可区分父母本的多态性引物。PCR扩增体系为10μL：PCR扩增混合试剂3.5μL，20 ng/μL上、下游引物各0.5μL，模板DNA 0.5μL，其余为灭菌超纯水。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性35 s，适当温度退火30 s，72℃延伸35 s，循环30个；72℃延伸8 min，4℃保存。采用 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增P进行分离，银染显色，统计条带并拍照保存。

1.3.3 “紫甘1号”杂交种的SSR鉴定 以在“紫甘1号”父母本间具有多态性的SSR引物作为扩增引物，单株编号200株“紫甘1号”杂交种进行PCR扩增及其电泳检测，将兼具“紫甘1号”父母本条带的单株统计为真杂交种并计算纯度。

1.3.4 田间表型性状鉴定 将上述200株单株编号的“紫甘1号”幼苗移栽至田间，常规管理，适时对品种生物学特征(如：叶球大小、紧实、色泽等)进行调查，按照纯度计算公式：种子纯度=(真杂交种株数/200)×100%计算纯度。

2 结果与分析

2.1 全基因组DNA提取结果分析

“紫甘1号”及其父母本全基因组DNA条带明亮单一，没有明显的降解现象，RNA去除效果较好(图1)，这表明利用改良的CTAB法提取紫甘蓝DNA效果较好，可用于后续的SSR分子标记多态性筛选实验。

图1 “紫甘1号”及其亲本DNA电泳图M为DL2000Marker；泳道1、2为F1；泳道3、4为父本；泳道5、6为母本

2.2 共显性引物的筛选

利用均匀分布于甘蓝染色体上的30对SSR引物对“紫甘1号”亲本进行多态性筛选，共得到具有多态性的标记11个，但共显性标记仅有1个，即引物Bo-005，引物序列为F(5'-3'):GAGTGTTTATTATCTGGGTCATT、R(5'-3'):GCA TACAGGTTTCATCCC，父本扩增条带大小为326bp，母本为308bp，利用Bo-005对“紫甘1号”DNA进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳，结果发现杂交种具有较清晰的双亲的互补带型(图2)。

图2 SSR引物在“紫甘1号”父母本间的扩增结果M为DL2000Marker；泳道1、2为SSR引物Bo-005；3-12泳道为其他引物

图3 SSR引物Bo-005鉴定“紫甘1号”杂交种纯度M为DL2000Marker；泳道1为父本；泳道2母本；泳道3-17为部分F1单株

2.3 杂交种纯度鉴定

为了验证筛选出的SSR共显性标记Bo-005在杂交种纯度鉴定中的实用性，我们利用Bo-005引物分别对编号的200株“紫甘1号”F1的基因组进行单株扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现196株杂交种具有双亲带型，4株仅有母本带型，编号分别为26，67，122，146。这表明200株“紫甘1号”F1中有196株为真杂交种，4株为混杂种，纯度为98%。

2.4 田间种株鉴定

为了验证SSR共显性标记Bo-005纯度鉴定的准确性，我们将单株编号的200株“紫甘1号”杂交种及亲本各10株定植于试验田，对其进行常规管理，适时调查株型、叶色、叶球大小、紧实度等品种生物学特征，结果发现，田间鉴定结果不仅纯度同样为98%，而且4株混杂种的编号与Bo-005标记鉴定结果完全一致。4株混杂种中有3株与母本特征完全一致，这可能是由于母本自交而来或者机械混杂所致；1株与母本相似，这可能是由于母本接受外来杂株花粉所致，而该杂株与母本在Bo-005标记位点不存在多态性。

3 结论与讨论

种子纯度是种子质量检验过程中非常重要的一项指标，在很大程度上影响品种的产量和品质，因此，种子纯度鉴定是种子销售前非常重要的一项工作。SSR标记鉴定方法是以植株的全基因组DNA为鉴定对象，鉴定结果不受环境影响，在穴盘育苗期即可完成鉴定，省去田间种植管理等繁琐过程，具有鉴定周期短、准确度高等优点，在其它作物中得到了大量的应用。王全等[6]利用 SSR 分子标记对黄瓜种子进行纯度鉴定，筛选出1对可用的 SSR 引物。方小雪等[7]利用72对SSR引物对“东之星”、“含香雪”两个甜瓜品种进行纯度鉴定，结果分别为99.2%和97.2%。本研究以“紫甘1号”杂种一代及其亲本为材料，利用30对SSR引物对种子纯度进行鉴定，结果表明：引物Bo-005在亲本具有共显性差异，对200株“紫甘1号”F1纯度鉴定结果为98%，与田间种植鉴定结果完全一致。其中，3株杂株的与母本完全一致，可能是由于母本自交或者机械混杂所致；1株杂株与母本相似，这可能是由于母本接受外来花粉所致，而该杂株的父本与母本在Bo-005标记位点不存在多态性。利用Bo-005标记鉴定“紫甘1号”杂交种纯度是一套快速、准确、稳定的种子纯度鉴定方法，完全可以满足“紫甘1号”杂交种的大规模纯度鉴定。

[1] 李 梅，张 斌, 刘 莉，等.“圆梦08”苦瓜杂交种纯度的SSR鉴定[J].种子，2015,34(4): 113-117.

[2] 鲁忠富，徐 沛，吴晓花，等.SSR分子标记技术在瓠瓜种子纯度快速鉴定中的应用[J].浙江农业学报，2012,24(4): 578-581.

[3] 张小康，朱运峰，陈玉霞，等. SSR分子标记技术在汉青一号萝卜种子纯度鉴定中的应用[J].湖北农业科学, 2016, 55(19):5069-5071.

[4] 姜 陆，卢 浩，王贤磊，等.快速检测甜瓜西州蜜17号种子纯度的SSR标记[J].新疆农业科学，2016，53(3):407-411.

[5] Li H.T., Chen X., Yang Y.2011, Development and genetic mapping of microsatellite markers from whole genome shotgun sequences in Brassica oleracea[J].Mol.Breeding,2016，28(4): 585-596.

[6] 王 全，张桂华，苗伟利.应用 SSR 技术进行黄瓜杂交种种子纯度鉴定[J].长江蔬菜，2009(4): 43-44.

[7] 方小雪，姚少林，薄永明.利用SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度[J].浙江农业科学，2016，57(2):178-181.

(编辑：严佩峰)

Application of SSR Molecular Marker Technique in Hybrid Purity Identification of Violet Cabbage of Zigan NO.1

MIAO Su-ping

(Department of Basic Science，Yangquan Teachers College，Yangquan 045000,China)

Zigan NO.1, Zigan NO.1 hybrid and their parents were used as materials in this research, DNA was extracted with CTAB method in cotyledon and detected with SSR molecular marker method, and the SSR identification results were compared with filed identification. The results showed that the primer Bo-005 was polymorphic between Zigan NO.1 and their parents. A total of 200 seedings of Zigan NO.1 were identified by Bo-005 , the obtained purity was 98%, completly identical to field identification. The Bo-005 could be applied to identify the purity of hybrid Zigan NO.1.

Zigan NO.1 ；purity of hybrid ；SSR molecular marker

2017-02-15

苗素平(1980—)，女，山西阳泉人，讲师，硕士，研究方向：生物化学与分子生物学.

S635.1

A

2095-8978(2017)02-0088-03