十八碳烯酸对人MGC-803细胞毒性作用机制研究

俞发荣，杨 博，连秀珍，谢明仁，李登楼，张诗爽，陈望军，郭蕴萱

(甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室， 甘肃 兰州 730070)

◇研究简报◇

十八碳烯酸对人MGC-803细胞毒性作用机制研究

俞发荣，杨 博，连秀珍，谢明仁，李登楼，张诗爽，陈望军，郭蕴萱

(甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室， 甘肃 兰州 730070)

人类与癌症的斗争已两千多年，至今已取得了突破性的进展。但是，癌症的危害仍未得到充分遏制。癌症不仅发病率、死亡率上升迅猛，而且发病年龄明显降低。癌症已由死因的第3位升至第1位，超过了脑血管病和心脏病，成为人类的“第一杀手”。寻找有效的抗癌症药物与方法, 彻底攻克癌症, 已成为无数科学家和临床医生梦寐以求的理想。从2002年开始至今，我们与美国佛罗里达大学生物技术研究中心合作，在前期研究的基础上，通过改进实验条件和方法，将甘肃猫儿眼(甘遂Euphorbiaceae:Euphorbiakansui)提取分离出十八碳烯酸，给予人胃癌细胞，研究对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其机制，为甘肃猫儿眼的进一步研究开发和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器 十八碳烯酸:由兰州大学化工学院天然植物研究所从甘肃天水产的猫儿眼提取分离制得，其组分由中国科学院兰州化学物理研究所采用GC-MS(HP6890/5973)分离，鉴定为十八碳烯酸(octadecenoic acid)，分子式：C18H32O2，分子质量：280.43，纯度:98.13%,为无色透明液体。实验时，用二甲基亚砜(DMSO)助溶加RPMI 1640培养液配制成所需浓度(DMSO含量为30 μl·L-1)；5-氟尿嘧啶(5-FU)：上海旭东海普药业有限公司生产，批号20150409. RPMI 1640：Grand Island N.Y.14072 USA； 胎牛血清：中美合资兰州民海生物工程有限公司生产，批号：20150603； 噻唑蓝(MTT)：上海生工生物工程技术服务有限公司提供；酶联免疫检测仪：购于上海雷勃分析仪器有限公司(MULTISKAN MK3)；流式细胞仪：Coulter EPICS XL型，USA； 96孔板：Costar 3599，Corning，NY14831，USA。

1.2 细胞系 人胃癌细胞系，由甘肃省医学科学研究院药理毒理实验中心惠赠。全部实验在甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室完成。

1.3 人胃癌细胞培养 将复苏的人胃癌细胞置于内含10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1链霉素的RPMI 1640培养液，5%CO2，37℃，饱和湿度条件中传代培养。

1.4 十八碳烯酸对人胃癌细胞毒性作用实验 取人胃癌细胞浓度为2×107个·L-1，接种于96孔培养板，每孔90 μL。十八碳烯酸：设3个浓度(0.2、0.4、0.8 mg·L-1，PBS液配制)，每孔加10 μL；5-FU组：每孔加5-FU(10 mg·L-1，PBS液配制)10 μL；对照组加等量PBS液。各设4个重复孔。置5%CO2孵育箱中37℃，饱和湿度条件培养。分别于培养6、12、18、24和48 h各取1板加0.4%台盼蓝每孔10 μL，用血球计数板在光镜下计活细胞数，取平均值，以时间为横坐标，活细胞数为纵坐标作图。

1.5 十八碳烯酸对人胃癌细胞增殖的影响 将人胃癌细胞置于内含10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1链霉素的RPMI 1640培养液，5%CO2，37℃，饱和湿度条件中培养。当细胞增殖生长到对数期，取培养细胞以2×107个·L-1的密度分别接种于96孔板，其中每孔加RPMI1640培养液180 μL。给药组：设3个浓度(0.2、0.4、0.8 mg·L-1，PBS液配制)，每孔加药20 μL；5-FU组：每孔加5-FU(10 mg·L-1，PBS液配制)20 μL；对照组加等量PBS液。每组4个重复孔。培养48 h后，加MTT(5 g·L-1，PBS液配制)每孔10 μL，孵育4 h，每孔加DMSO 100 μL，振荡10 min，用酶联免疫检测仪在494 nm处测其OD值，计算细胞增殖抑制率(IR%)。

1.6 十八碳烯酸对人胃癌细胞凋亡的影响 取15 mL培养瓶7个，每瓶加RPMI1640培养液6 mL，加人胃癌细胞液2 mL(细胞密度为2×107个·L-1)，给药组分别加入十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-Fu各0.8 mL；空白对照组加等量的PBS，培养48 h后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，加入70%冷乙醇固定24 h，离心弃乙醇，加PBS洗1次，加入Rnase(200 mg·L-1) 0.5 mL,37℃放置4 h，离心，弃上清，PBS洗一次，加0.5 mL碘化丙啶(propidium iodine, PI,20 mg·L-1),4℃，避光染色30 min，用流式细胞仪测定凋亡率。

1.7 统计学处理 实验数据采用SPSS17.0软件进行统计学处理。十八碳烯酸对人胃癌细胞毒性作用以百分比表示，组间差异采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 十八碳烯酸对人胃癌细胞毒性作用 分别给予人胃癌细胞5-FU和十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1培养48 h，在光镜下计数活细胞，结果发现活细胞数随给药浓度的增加和作用时间的延长而减少。

2.2 十八碳烯酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用 分别给予人胃癌细胞十八碳烯酸0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-FU培养48 h，用MTT法测定，人胃癌细胞增殖抑制率分别为46.48%、62.99%、74.92%和60.55%，半数抑制浓度(IC50)为0.21 mg·L-1。

2.3 十八碳烯酸对人胃癌细胞凋亡的影响 分别给予人胃癌细胞十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-FU培养48 h，用流式细胞仪测得凋亡率分别为16.42%、21.26%、25.64%和18.23%。见Tab 1。

Tab 1 Effects of octadecenoic acid on MGC-803 cell apoptosis

3 讨论

十八碳烯酸是从甘肃猫儿眼(甘遂)中提取分离出的多不饱和脂肪酸[1]。多不饱和脂肪酸是人体必需的不饱和脂肪酸[2]，是重要的营养物质[3]。多不饱和脂肪酸能通过诱导细胞凋亡[4]，抑制肿瘤细胞的增殖[5]和血管生成[6]，并能抑制肿瘤细胞的侵袭[7]和转移[8]。本文将十八碳烯酸给予人胃癌细胞分别于培养6、12、18、24和48 h，台盼蓝染色(正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；细胞膜结构破环，通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色)、MTT法检测(活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度，活细胞越多，吸光度就越高；若线粒体结构损伤，不能将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜，吸光度就随之降低)和光学显微镜观察结果，随给药浓度的增加和培养时间的延长，破裂死亡的细胞数增多，细胞增殖的抑制率就越高；流式细胞仪检测结果显示，给药组G0期和G1期细胞数比对照组明显升高，G2期和M期细胞明显减少，细胞阻滞于G0期和G1期，进入G2期和M期的细胞减少,起到抑制细胞分裂增殖和促进细胞凋亡的作用。

以上结果表明，十八碳烯酸对人胃癌细胞具有明显的毒性作用，其机制与十八碳烯酸破坏细胞膜结构，抑制细胞分裂，损伤线粒体结构，导致细胞凋亡、破裂、死亡等有关。实验结果为进一步研究开发和十八碳烯酸的临床应用提供了实验依据。

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Toxicity mechanism of octadecenoic acid on MGC-803 cells

YU Fa-rong, YANG Bo, LIAN Xiu-zhen, XIE Ming-ren, LI Deng-lou, ZHANG Shi-shuang, CHEN Wang-jun， GUO Yun-xuan

(KeyLaboratoryofEvidenceofScienceandTechnologyResearchandApplication,GansuProvince,Lanzhou730070,China)

甘肃猫儿眼；十八碳烯酸; 人胃癌细胞；毒性作用; 细胞增殖; 细胞凋亡

maoeryan of Gansu origin； octadecenoic acid; MGC-803 cells; toxic effect；cell proliferation；cell apoptosis

时间：2017-5-25 17:44 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.056.html

201701-03，

2017-02-18

甘肃省基础研究创新群体项目(No 145RJIA333)；兰州市科技计划项目(No 2014-1-182; 2015-3-80)；兰州市人才创新创业项目；甘肃省高校科技创新团队项目(No 2016C-09)；西北民族地区侦查理论与实务研究中心项目；甘肃政法学院重大科研项目

俞发荣(1959-)，男，博士，研究员,研究方向：肿瘤药物学、行为心理学,E-mail: tim9898@163.com; 谢明仁(1977-),男，硕士，副教授，研究方向：物证科学技术,通讯作者，E-mail: xmr7600@gsli.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.028

A

1001-1978(2017)06-0887-02

R282.71；R329.24；R329.25；R735.202.2