丝胶对STZ致损伤INS-1细胞活性和胰岛素分泌的影响*

王小杰，刘美晓，谢云鹏，孙一婵，陈志宏△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

丝胶对STZ致损伤INS-1细胞活性和胰岛素分泌的影响*

王小杰1，刘美晓1，谢云鹏2，孙一婵1，陈志宏1△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

目的:探讨丝胶对STZ致损伤的大鼠胰岛素瘤INS-1细胞活性和胰岛素分泌的影响。方法：以链脲佐菌素（STZ）诱导INS-1细胞损伤，细胞分为正常组、STZ组和丝胶组(300μg/L)。普通光学倒置显微镜观察各组细胞的一般状态；MTT法测定细胞活性；ELISA法检测培养上清中胰岛素的含量。结果：与正常组相比，STZ组细胞活性明显下降，培养上清中胰岛素的含量明显降低（P＜0.05）。经300μg/L丝胶处理后，INS-1细胞活性、培养上清中胰岛素的含量均明显升高（P＜0.05）。结论：丝胶蛋白可提高STZ致损伤大鼠胰岛素瘤INS-1细胞的活性，以及促进胰岛素的分泌。

丝胶；链脲佐菌素（STZ）；INS-1细胞；细胞活性；胰岛素分泌

目前，糖尿病已经成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病[1]。在全球糖尿病患者中，90%以上属于2型糖尿病。2型糖尿病主要以血糖升高、胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能受损等为主要特征[2]。如何降低血糖，保护胰岛，促进β细胞分泌胰岛素是治疗2型糖尿病的关键。丝胶是从蚕茧中提取的天然蛋白质，本课题组前期研究采用链脲佐菌素（STZ）致2型糖尿病大鼠模型，发现丝胶可有效降低血糖[3]。但丝胶降血糖的机制尚需进一步深入研究。为进一步探讨丝胶降血糖的作用机制，本研究以STZ诱导大鼠胰岛素瘤INS-1细胞损伤，观察了丝胶对INS-1细胞活性和胰岛素分泌的影响，为进一步探讨丝胶治疗糖尿病的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠胰岛素瘤INS-1细胞株，上海赛百慷细胞库；STZ，美国Sigma公司；MTT，美国GIBCO公司；ELISA胰岛素检测试剂盒，北京艾然生物科技有限公司；丝胶（sericin），由彩色蚕茧（承德医学院蚕业研究所提供）中提取，冷冻干燥成粉末备用，使用时用培养基溶解。

1.2 细胞培养 INS-1细胞在37℃、5% CO2条件下， 置于含NaHCO31.5g/L，D-葡萄糖13.8mmol/L，10%胎牛血清、50μmol/Lβ -巯基乙醇的RPMI-1640培养基中培养。细胞随机分为3组：正常组、STZ组和丝胶组，其中正常组细胞不作任何处理，STZ组以10mmol/L STZ作用INS-1细胞24h，丝胶组在以10mmol/L STZ处理INS-1细胞的同时以终浓度为300μg/L的丝胶作用24h。普通光学倒置显微镜观察各组细胞的一般状态。

1.3 MTT法检测各组细胞活性 将对数生长期的各组细胞接种于96孔板，5×103个/孔，每组设5个复孔，分别设空白组（只加培养基不加细胞）、正常组和药物组（STZ组和丝胶组）。每孔加入MT（T5mg/ml），作用4h后每孔加入150μl DMSO充分溶解甲瓒，于酶标仪波长492nm处测定各孔的吸光度（OD492）值，取6孔的平均值，OD值的改变表示细胞活性的改变。

1.4 ELISA法检测各组细胞上清中胰岛素含量 收集各组细胞上清离心后，采用ELISA检测细胞上清中胰岛素含量，用酶标仪在波长492nm处测检测吸光度（OD492）值。

1.5 统计分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行处理，所有数据以均值±标准差（±s）表示，组间比较采单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞的一般状态（见附图） 与正常组细胞相比，STZ组INS-1细胞形态发生了不规则形变，细胞内颗粒状物质增多；丝胶组INS-1细胞形态较为规则，胞质透明，细胞内颗粒物质较少，更为接近正常组的细胞状态。

附图 各组细胞的一般形态

2.2 各组INS-1细胞的活性 与正常组相比，STZ组INS-1细胞活性明显下降（P＜0.05）；与STZ组相比，丝胶组INS-1细胞活性显著升高（P＜0.05，附表）。说明丝胶可明显提高STZ致损伤INS-1细胞的活性。

附表 各组INS-1细胞活性和细胞上清胰岛素含量（n=6，±s）

附表 各组INS-1细胞活性和细胞上清胰岛素含量（n=6，±s）

与正常组相比：*P＜0.05；与STZ组相比：#P＜0.05

组别 细胞活性（OD492） 上清胰岛素含量（μIU/ml）正常组 0.753±0.025 5.943±0.025 STZ组 0.457±0.035* 5.267±0.031*丝胶组 0.673±0.012# 5.793±0.015#

2.3 各组INS-1细胞上清胰岛素的含量 与正常组相比，STZ组INS-1细胞上清中胰岛素的含量明显下降（P＜0.05）；与STZ组相比，丝胶组细胞上清中胰岛素的含量显著升高（P＜0.05，附表）。说明丝胶可明显改善STZ致损伤INS-1细胞的胰岛素分泌功能。

3 讨论

近年来，糖尿病尤其是2型糖尿病的发病率逐年上升，已严重威胁人类的健康。当前治疗糖尿病的方法总体上仍以药物治疗为主。各类药物虽能较好地控制血糖，但大多药物均有不同程度的副作用，有相当一部分人短时间内即可出现肝肾损害[4]。因此，近年来国内外研究者将目光转向了具有降糖作用的天然物质。丝胶是从天然彩色蚕茧中提取的由18种氨基酸组成的水溶性蛋白，具有生物相容性，可生物降解，对人体无毒性，可避免化学合成药物带给人体的毒副作用[5]。本课题组前期研究表明，丝胶可有效降低STZ致2型糖尿病大鼠的血糖、调节血脂代谢紊乱、保护胰岛细胞、海马、性腺及肾脏，且丝胶预处理亦有类似的作用[3，6-9]。

为进一步探讨丝胶是否通过保护胰岛细胞发挥降血糖作用，本研究特选取了大鼠胰岛素瘤INS-1细胞，该细胞是在SV40冰冻转染的胰岛细胞基础上建立的，有较好的稳定性，可在糖、胰高血糖素刺激下分泌胰岛素，并被糖皮质激素所抑制，故INS-1细胞是体外研究胰岛细胞功能的理想模型[10]。本研究以STZ诱导INS-1细胞损伤，观察了丝胶蛋白对胰岛INS-1细胞活性和胰岛素分泌功能的影响，结果发现经300μg/L丝胶处理细胞后，STZ诱导损伤的INS-1细胞活性、上清液中胰岛素的含量均明显升高。说明丝胶可能通过增强胰岛细胞活力、促进胰岛细胞分泌胰岛素发挥降血糖作用。

[1]Catherine K, Katherine M, Robert H. Gestational diabetes and the incidence of type 2 diabetes: a systematic review[J]. Diabetes Care, 2002, 25(10): 1862-1868.

[2]Chen L, Magliano DJ, Zimmet PZ. The worldwide epidemiology of type 2 diabetes mellitus--present and future perspectives[J]. Nat Rev Endocrinol, 2011, 8(4): 228-236.

[3]付秀美，钟美蓉，付文亮，等.丝胶对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响[J].中国老年学杂志，2011，31(1)：103-105.

[4]Bodmer M, Meier C, Krähenbühl S, et al. Metformin, sulfonylureas, or other antidiabetes drugs and the risk of lactic acidosis or hypoglycemia: a nested case-control analysis[J]. Diabetes Care, 2008, 31(11):2086-2091.

[5]张海萍，朱良均，胡虹.丝胶蛋白固定化L-天冬酰胺酶的特性研究[J].蚕桑通报，2003，34(1)：16-19.

[6]陈志宏，宋成军，付秀美，等.丝胶预处理对DN大鼠肾脏细胞外基质相关蛋白表达的影响[J].中国医科大学学报，2010，39(2)：112-115.

[7]付秀美，马洪伟，付文亮，等.丝胶对Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用[J].解剖学杂志，2010，33(2)：161-164.

[8]付文亮，付秀美，钟美蓉，等.丝胶对2型糖尿病大鼠睾丸生长激素/胰岛素样生长因子-1轴的作用[J].解剖学报，2011，42(1)：104-109.

[9]Zhihong Chen, Yaqing He, Wenliang Fu, et al. Effects of sericin on heme oxygenase-1 expression in the hippocampus and cerebral cortex of type 2 diabetes mellitus rats[J]. Neural Regeneration research, 2011, 6(6): 423-427.

[10]任文辉，张保丽，李中平，等.芍药苷对STZ损伤的INS-1细胞的保护和修复作用[J].中国老年学杂志，2011，31(2)：230-232.

(基础医学栏目编辑：陈志宏)

EFFECTS OF SERICIN ON CELL VIABILITY AND INSULIN SECRETION OF STZ INJURED INS-1 CELLS

WANG Xiao-jie, LIU Mei-xiao, XIE Yun-peng, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of sericin on cell viability and insulin secretion of streptozotocin (STZ) injured rats’ insulinoma INS-1 cells. Methods: The INS-1 cells were randomly divided into normal group, STZ group and sericin group. The cells in STZ group were cultured with STZ(10mmol/L) for 24h; the cells in sericin group were cultured with STZ(10mmol/L) and sericin (300μg/L) at the same time for 24h. The general state of INS-1 cells was observed by optical inverted microscope, MMT to detect the cell viability of INS-1 cells and ELISA to detect the insulin content in supernate. Results: Compared with normal group, the cell viability and insulin content in supernate of INS-1 cells decreased obviously (P＜0.05); After treating with sericin (300μg/L) , the cell viability and insulin content in supernate of INS-1 cells increased obviously (P＜0.05). Conclusions: Sericin can promote insulin secretion by enhancing the cell viability of STZ injured rats’insulinoma INS-1 cells.

Sericin; Streptozotocin (STZ); INS-1 cells; Cell viability; Insulin secretion

R587.1

A

1004-6879（2017）03-0190-03

2016-08-20）

* 国家自然科学基金资助项目（81441133），河北省自然科学基金资助项目（H2013406096），河北省教育厅青年基金项目（QN20131089）

△ 通讯作者