氨茶碱对SD大鼠脂肪间充质干细胞增殖能力的影响

张洋洋，杨林瀛，庞桂芬，刘 娜，姜 锋

（承德医学院附属医院，河北承德 067000）

氨茶碱对SD大鼠脂肪间充质干细胞增殖能力的影响

张洋洋，杨林瀛，庞桂芬△，刘 娜，姜 锋

（承德医学院附属医院，河北承德 067000）

目的:探讨氨茶碱对SD大鼠脂肪间充质干细胞（ASCs）增殖能力的影响。方法：分离培养SD大鼠ASCs，取第3代ASCs，不同浓度氨茶碱（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）作用ASCs 48h，台盼蓝染色检测各组细胞的存活率，MTT法绘制细胞生长曲线。结果：不同浓度氨茶碱组ASCs存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；相同培养时间、不同浓度氨茶碱组ASCs增殖能力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：在体外培养条件下，治疗浓度的氨茶碱对ASCs的存活率和增殖无明显影响。

氨茶碱；脂肪间充质干细胞；细胞增殖；细胞培养

【KEY WORDS】 Aminophylline; Adipose tissue-derived stem cells; Proliferation; Cell culture

间充质干细胞（MSCs）是来源于中胚层的成体干细胞，具有抗炎、免疫调节和促进组织修复等作用。脂肪来源的MSCs（ASCs）易于分离和纯化，是较为理想的MSCs来源[1]。目前，MSCs对脑卒中、心肌梗死等疾病的治疗已进行到临床试验阶段，而亦有多项临床前研究显示，MSCs对慢性阻塞性肺疾病（COPD）可能具有潜在的治疗意义[2-4]。氨茶碱是国内治疗COPD的常用药物之一，如治疗需要同时应用ASCs和氨茶碱，应明确二者是否存在相互作用，但目前国内外尚无相关实验研究。本研究拟通过体外研究初步探讨茶碱对ASCs的存活及增殖的影响，对未来临床应用ASCs提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 4周龄SPF级健康雄性SD大鼠4只，体重60-80g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK(京)2012-0001）。实验中对动物的处置遵守《关于善待实验动物的指导性意见》相关要求。主要试剂：ASCs专用培养基（Sciencell，美国），Ⅰ型胶原酶、台盼蓝染液（Sigma，美国），0.25%胰蛋白酶-EDTA（北京索莱宝科技有限公司），MTT（Amerison，美国）。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠ASCs的分离培养和传代：SD大鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇消毒10min后剪开腹部皮肤，剪取腹部后外侧皮下脂肪组织，无菌PBS冲洗3次，去除血管和纤维成分后充分剪碎，加入约10倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃水浴震荡消化30min，1000r/min离心10min弃上清，PBS洗涤后再次离心弃上清，ASCs专用培养基重悬，接种于培养皿中，37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，48h后首次换液，以后每3天换液1次。细胞长至约80%融合，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1min，加入含血清的培养液中和胰蛋白酶终止消化，以1:3传代培养。

1.2.2 ASCs存活率检测：取第3代ASCs，消化后以1×104个/孔接种于6孔板，48h后进行药物处理，分为氨茶碱0μg/ ml（对照组）、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml 4组，每组3个复孔。继续培养48h后消化、离心及重悬细胞，取细胞悬液各5μl与5μl体积分数0.4%台盼蓝染液混合，1min后滴入细胞计数板。显微镜下观察计数，死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染。细胞存活率（%）=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。每组取3个复孔的平均值。

1.2.3 ASCs增殖能力检测：取第3代ASCs，消化后以1×103个/200μl/孔接种于96孔板，24h后进行药物处理，分组同前，每组5个复孔。每天取1块96孔板，共7天，每孔加入20μl MTT，孵箱中孵育4h后吸去培养液，每孔加入150μl DMSO，摇床振荡10min，酶标仪490nm处测定吸光值（A值），绘制细胞生长曲线。

1.3 统计分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，多组间计量资料的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASCs存活率检测结果 氨茶碱0μg/ml组、5μg/ml组、10μg/ml组、20μg/ml组ASCs存活率分别为（95.65±1.23）%、（95.60±1.32）%、（95.54±2.27）%、（95.72±2.76）%，各组ASCs存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 ASCs增殖能力检测结果 随着培养时间的延长，各组细胞吸光度值逐渐升高，第1-5天吸光度值升高幅度较快，第5天后吸光度值升高速度减慢，提示细胞进入增殖平台期。相同培养时间、不同浓度氨茶碱组ASCs吸光度值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见附表：

附表 ASCs不同培养时间的吸光度值（±s，n=5）

附表 ASCs不同培养时间的吸光度值（±s，n=5）

氨茶碱浓度0μg/ml 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml 1d 0.193±0.003 0.192±0.003 0.192±0.001 0.190±0.002 2d 0.293±0.008 0.298±0.015 0.294±0.005 0.291±0.007 3d 0.418±0.006 0.418±0.006 0.416±0.014 0.414±0.013 4d 0.632±0.010 0.634±0.012 0.632±0.005 0.631±0.012 5d 0.706±0.006 0.707±0.014 0.705±0.009 0.705±0.005 6d 0.716±0.008 0.717±0.004 0.715±0.006 0.714±0.006 7d 0.724±0.013 0.726±0.019 0.722±0.009 0.721±0.009培养时间

3 讨论

COPD以持续性、进展性气流受限为特征，与气道和肺脏对吸入的有害气体或颗粒的慢性炎症反应增强有关，严重危害人们的身体健康。据全球疾病负担研究项目估计，2020年COPD将位居全球死亡原因的第3位。最新一项Meta分析显示[5]，中国40岁以上人群COPD的患病率为9.9%。茶碱类药物应用于COPD、哮喘等呼吸道疾病已有70余年，虽然副作用较多，中毒浓度（＞20-25μg/ml）接近治疗浓度（10-20μg/ml），但我国COPD指南中指出血液中茶碱浓度＞5μg/ml即有治疗作用，可在COPD患者中应用。

氨茶碱为茶碱和乙二胺的复合物，约含茶碱77%-83%。茶碱为甲基黄嘌呤类药物，能抑制磷酸二氢酶，降低环磷酸腺苷（cAMP）的水解速度，从而提高平滑肌细胞内cAMP的浓度，cAMP/cGMP比值升高开放钙激活的钾通道，从而松弛支气管平滑肌；茶碱还可影响内源性儿茶酚胺的释放，激活β2受体而舒张支气管平滑肌。治疗浓度氨茶碱的主要作用是舒张气道、改善肺通气，在较低的血浆浓度（5-10μg/ml）时具有抗炎和免疫调节作用，如：①能够抑制中性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞的活化[6];②抑制IL-4、组胺等炎症介质的释放，以减轻气道高反应性[7];③减少炎症介质对气道上皮的刺激[6-8],减少TGF-β1的分泌， 可能具有延缓气道重塑的作用[6,8-9]。

ASCs是近年研究较多的成体干细胞，因来源丰富，易于分离和纯化，成为目前细胞治疗的理想细胞来源之一。药物可能会影响MSCs的增殖、凋亡等生物学特性，如他汀类药物在体外可抑制MSCs的增殖[10]。作为国内治疗COPD的常用药物，氨茶碱与ASCs之间是否存在相互作用，目前国内外尚未见相关研究报道。为此，本研究初步探讨了治疗浓度的氨茶碱对ASCs存活和增殖能力的影响。结果显示，与对照组比较，不同浓度氨茶碱（5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）作用ASCs后，细胞存活率无明显差异；并且发现，相同培养时间、不同浓度氨茶碱组ASCs增殖能力亦无明显差异。本研究提示，治疗浓度的氨茶碱在体外对ASCs的存活和增殖无明显影响。关于氨茶碱与MSCs的其它相互作用，本课题组将进一步深入探讨。

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EFFECT OF AMINOPHYLLINE ON PROLIFERATION OF ADIPOSE TISSUE-DERIVED STEM CELLS OFSD RATS

ZHANG Yang-yang, YANG Lin-ying, PANG Gui-fen, et al
(the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To explore the effects of aminophylline on proliferation of adipose tissue-derived stem cells (ASCs) of SD rats. Methods: ASCs of SD rats were isolated and cultured to the third generation. Trypan blue staining was used to detect the survival rate of ASCs, MTT methods to draw growth curve after the ASCs were cultured with aminophylline of different concentration (0μg/ml, 5μg/ml, 10μg/ml, 20μg/ml) for 48h. Results: There was no signif i cant difference about survival rate of ASCs in different concentration aminophylline group (P＞0.05). There was no significant difference about proliferation of ASCs at same culture time and of different concentration of aminophylline (P＞0.05). Conclusions: Treatment concentration of aminophylline has no obvious effects on survival rate and proliferation of ASCs in vitro.

R974

A

1004-6879（2017）03-0183-03

2016-09-13）

△ 通讯作者