气相色谱质谱联用测定奶牛血清中的β-羟丁酸

董春光， 武守艳， 杨丽华， 韩文儒， 赵晶晶， 陈剑波， 韩一超， 王俊东

(1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 山西太原030032 ； 2.山西省饲料兽药监察所 ， 山西太原030027 ；3.山西农业大学动物科技学院 ， 山西太谷030801)

(1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 山西太原030032 ； 2.山西省饲料兽药监察所 ， 山西太原030027 ；3.山西农业大学动物科技学院 ， 山西太谷030801)

为了建立测定奶牛血清中代谢产物β-羟丁酸含量的气相色谱-质谱联用方法，为奶牛酮病的早期诊断提供新途径。将奶牛血清样品用甲醇除蛋白，上清液经氮气吹干，残渣进行硅烷化衍生后，用GC-MS仪全扫描方式进行检测。结果测定血清中β-羟丁酸的线性范围为0.05 mmol/L～8 mmol/L，相关系数R=0.9995，检测限为0.03 mmol/L，定量限为0.05 mmol/L,相对标准偏差RSD=5.79%，样品加标回收率为95.10%～99.91%。表明该方法能简便、快速、有效地分离并定量检测血清中的β-羟丁酸，可以作为奶牛酮病的早期诊断依据。

气相色谱-质谱法 ； β-羟丁酸 ； 奶牛酮病

奶牛酮病是泌乳牛常见的营养代谢性疾病。当奶牛的采食量不能满足泌乳所消耗的能量需要时出现能量负平衡，从而产生过多的酮体，超过了机体自身组织能够利用的限度时，就会在机体内蓄积，引起酮病。血液生化表现为血、尿、乳中的酮体(β-羟丁酸、丙酮、乙酰乙酸)含量增加。

在我国高产牛群中，临床型酮病的发病率一般占产后母牛的2%～20%，而亚临床型酮病的发病率则更高，占产后母牛的10%～30%[1]。酮病的发生直接导致治疗费用增加、奶牛产奶量大幅度降低、乳成分改变、繁殖率降低以及淘汰率升高[2]，同时也能继发母牛的营养不良和不孕症，不仅给牧场造成很大的经济损失，而且病牛的奶被人食用后还可能会影响人的健康[3]。在生产中，临床型酮病有比较明显的症状，容易诊断，而对于亚临床型酮病，由于没有明显的临床症状，给诊断带来很大的困难，对奶牛养殖业造成的损失更大[4]。目前常用的诊断酮病的方法大多还是通过显色反应定性鉴别的方法，不能准确、定量地判断疾病的程度和发展过程，因此建立一种能够尽早地、简单快速地进行酮体定量检测的新方法具有非常重要的现实意义。

气相色谱-质谱联用作为一种高效的分离分析方法，具有灵敏度高、应用范围广等优点[5]，近年来在疾病诊断，尤其是在疾病的早期诊断及进一步阐明发病机制方面，发挥出越来越重要的作用，而目前尚未见到用于检测奶牛血清酮体β-羟丁酸含量从而诊断奶牛酮病及其患病程度的报道。本试验旨在建立气相色谱-质谱分析技术运用于酮病早期诊断的新方法，以期尽早诊断酮病，减少损失。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 6890N-5973I气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)；高速冷冻离心机(德国郝黎氏公司)；甲醇(色谱纯，美国Dikma公司)；β-羟丁酸(纯度98%，美国Alfa Aesar)，甲氧胺盐酸盐(纯度98%，美国Sigma-Aldrich公司)；N, O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1，美国Sigma-Aldrich Fluka公司)；吡啶(分析纯，北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 对照溶液的配制 精确称取β-羟丁酸标准品0.104 g于50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为20 mmol/L的β-羟丁酸标准储备液(-20 ℃储存备用)。准确移取一定量的储备液于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使其逐级稀释成8 mmol/L，4 mmol/L，2 mmol/L，0.8 mmol/L，0.2 mmol/L，0.05 mmol/L，0.03 mmol/L的标准溶液，4 ℃保存备用。

1.3 样本处理 取奶牛血清样品200 μL，加入甲醇200 μL，旋涡振荡30 s，10 000 r/min (4 ℃)离心10 min后取上清液于小玻璃瓶中，温和氮气吹干，向残渣中加入20 mg/mL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液80 μL，旋涡振荡30s，37 ℃孵化90 min，再加入120 μL BSTFA+TMCS硅烷化试剂，70 ℃衍生1 h，4 ℃离心后取上清液供气相色谱-质谱测定。

1.4 气相色谱-质谱条件 色谱柱：HP-5MS玻璃毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样量为1 μL，进样口温度：280 ℃；柱温：80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升温至300 ℃，保持6 min；传输线温度：250 ℃；离子源(EI)温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；载气：氦气(99.99%)，流速：1 mL/min，质量扫描范围：50～600 AMU；溶剂延迟时间：3.2 min。

2 结果

2.1 样品前处理及检测条件的优化 血清中加入甲醇后产生大量的白色沉淀，经过10 000r/min离心后，可以除去样品中的沉淀物，上清液经氮气吹干后即可完全除去甲醇，得到少量固体物质。再经过衍生化反应后得到清亮的液体，进行气相色谱-质谱分析，可得到总离子流图和质谱图(图1)。结果表明，此样品处理方法既可有效去除杂质，又可充分提取目标物质，适合于气相色谱-质谱分析。对不同浓度的β-羟丁酸在分流进样和不分流进样模式下的信噪比进行比较，当浓度低于0.2 mmol/L时，不分流模式的信噪比比分流模式高，仍可保持较高的敏感性，因此选用不分流进样模式。

2.2 方法的线性关系、检测限及定量限 将1.2项中逐级稀释的7个浓度的β-羟丁酸标准工作溶液，分别经1.3项的方法进行处理后，在1.4项的气相色谱和质谱条件下进行测定，结果见表1。

表1 方法的线性方程、相关系数及线性范围

在β-羟丁酸浓度为0.03 mmol/L时，信噪比S/N=3.7，β-羟丁酸浓度为0.05 mmol/L时，信噪比S/N=12.7，确定该方法的检测限为0.03 mmol/L，定量限为0.05 mmol/L。β-羟丁酸标准工作溶液的总离子流图和质谱图见图1a，1b。

2.3 精密度试验 取同一标准工作溶液(0.8 mmol/L)200 μL按上述相同的样品处理方法和气相色谱-质谱条件重复测定6次(表2)，计算该方法的精密度。测得该方法的精密度RSD为5.79%。

表2 精密度试验

2.4 加标回收试验 取某一奶牛血清样品4份，每份200 μL，分别加入0 μL，80 μL，100 μL，120 μL的β-羟丁酸(2 mmol/L)标准溶液，按上述相同的前处理和气相色谱-质谱条件，每个添加量重复进样5次，检验方法的加标回收率(结果见表3)。测得β-羟丁酸的加标回收率为95.10%～99.91%。

表3 不同添加量的加标回收率

a

b

3 讨论

酮体是β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮的总称。通常情况下，β-羟丁酸的含量占78%、乙酰乙酸和丙酮分别占20%和2%[6]。目前在酮病诊断方法中，多利用特定试剂与乙酰乙酸的显色反应来达到检测酮体的目的，但是，由于乙酰乙酸在酮体中所占比例较小，且性质不稳定，容易分解成丙酮和二氧化碳，对检测结果的影响较大，因此，本试验以β-羟丁酸作为检测对象，提高了检测的准确性。

气相色谱-质谱法以其自身的优势，近年来已在疾病诊断、药物分析、代谢产物的分离分析等微量成分分析各领域得到广泛应用[5, 7]。由于动物血清中含有大量蛋白质、脂肪酸及胆固醇等有机物，而这些物质具有一定的粘附性，很容易在色谱柱上吸附，从而影响色谱柱的使用寿命，因此，在运用GC-MS进行分析之前，为了保护色谱柱以及减少对测定的干扰，需要进行除蛋白质等前处理步骤。除蛋白质是应用有机溶剂沉淀去除血清中所含的大量蛋白质成分[8]，目前常用的除蛋白试剂有甲醇、乙腈、甲醇/乙醇等[9]，用甲醇除蛋白操作简单且效果显著[10]，因此，本试验采用了甲醇作为除蛋白试剂。

气相色谱检测的衍生化方法有硅烷化衍生化、酯化衍生化、酰化衍生化等，目的是将难挥发或热不稳定化合物通过化学反应转变成易挥发和稳定的化合物，更利于进行CC-MS分析。本试验中利用硅烷化试剂将硅烷基引入到分子中，取代了羧基中的活性氢，从而降低了化合物的极性，形成的衍生物更容易挥发，同时稳定性也得到了加强。从试验的线性关系，加标回收率等指标可以看出，该衍生化方法的衍生效果可以满足检测的要求。

4 结论

该检测方法的分离效果好，灵敏度高，检测范围广，可以准确检测血清中β-羟丁酸的含量，为早期准确诊断奶牛酮病提供新的途径。

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Determination of β-hydroxybutyrate in cow serum by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

DONG Chun-guang1, WU Shou-yan1, YANG Li-hua1, HAN Wen-ru1, ZHAO Jing-jing2, CHEN Jian-bo1, HAN Yi-chao1, WANG Jun-dong3

(1.Animal Husbandry and Veterinary Institute, Shanxi Academy of Agricultural Science, Taiyuan 030032, China; 2.Shanxi Province Institute of Feed and Veterinary Drug Control, Taiyuan 030027, China; 3.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

To establish the method of gas chromatography-mass spectrometry for measuring β-hydroxybutyrate in cow serum and provide a new way to diagnose dairy ketosis. Methanol was used for precipitating the proteins and supernate was dried by nitrogen. The concentrate was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry after derivatization with slilylreagents. Linear relation of β-hydroxybutyrate detected in cow serum ranged from 0.05mmol/L to 8mmol/L. The correlation coefficient was 0.9995. The detection limit was 0.003mmol/L and the limit of quantitation was 0.05mmol/L. Relative standard deviation was 5.79% and the adding standard recovery was 95.10% to 99.91%. The method can separate and detect β-hydroxybutyrate in dairy serum simply, rapidly and effectively, and it is suitable for early diagnosis of dairy ketosis.

Gas chromatography-mass spectrometry ; β-hydroxybutyrate ; Dairy ketosis

s：HAN Yi-chao ; WANG Jun-dong

2016-04-06

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2012BAD12B06-2)；山西省农业科学院畜牧兽医研究所课题(xms201502)

韩一超，E-mail:hyc7092502@126.com；王俊东，E-mail：wangjd53@outlook.com

S854.4

A

0529-6005(2017)05-0101-03