四君子散对家兔生长性能和部分免疫学指标的影响

王毅东 ， 王东林 ， 冯 韬 ， 陈红伟

(西南大学荣昌校区动物医学系 ， 重庆荣昌402460)

四君子散对家兔生长性能和部分免疫学指标的影响

王毅东 ， 王东林 ， 冯 韬 ， 陈红伟

(西南大学荣昌校区动物医学系 ， 重庆荣昌402460)

选择36只45日龄新西兰断奶仔兔， 研究日粮中添加不同含量的中药四君子散对生长性能及其免疫功能的影响， 设高剂量5%、 中剂量3%、 低剂量1%组、 空白对照组。 饲喂时间为一个月， 从第1天开始进行体重称量， 每10天进行一次体重采集； 饲喂结束对家兔无菌采血， 进行外周血淋巴细胞增殖试验， 同时处死家兔解剖后称取免疫器官重量。 结果显示， 四君子散高、 中剂量组可显著促进外周血淋巴细胞的增殖。 表明了四君子散对家兔免疫功能有促进作用。

四君子散 ； 器官指数 ； MTT ； 家兔

四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草组成，现代药理研究主要围绕该方的主治和功能，并结合脾虚证本质的研究，从多方位、多角度进行了大量药理研究工作，发现该方具有较为广泛的药理活性，主要集中表现在调节胃肠运动，促进消化吸收功能和免疫调节、促进代谢方面，其他如抗肿瘤、抗溃疡、促进微循环等也有报道[1]。动物临床中常用其散剂。

目前四君子汤/散在动物体内开展的相关研究多集中在从中兽医理论角度改善或调理脾虚症，又如魏彦明开展了四君子汤对家兔脾虚症调整作用的实验研究，以及脾虚证模型家兔神经内分泌机能的变化及四君子汤对其调整作用等[2,3]。本文拟通过现代免疫药理学方法，结合家兔生长性能等综合考查四君子散在家兔体内的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要试验药品 MTT(四甲基偶氮唑盐)(Sigma公司产品)；ConA(刀豆蛋白A)(Sigma公司产品)等。

1.2 试验动物 45日龄新西兰断奶仔兔，雌雄各半。

1.3 主要仪器设备 3-18K高速台式冷冻离心机：德国Sigma公司；KS200型饲料颗粒机：山东省枣庄腾达饲料机械厂；SL-200型高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金工具厂；DW 86L386型立式超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 试验设计 本试验采用完全随机区组设计，将36只45日龄新西兰断奶仔兔，分成4组。分别是高剂量(饲料中四君子散的含量为5%)、中剂量(饲料中四君子散的含量为3%)、低剂量(饲料中四君子散的含量为1%)和空白对照4个组，每个组3个重复，每个重复3只兔子，进行为期30天的动物饲养试验；饲养过程中进行饲养前、中、后3次体重称量；饲养结束，进行无菌采血和免疫器官采集、重量的称量，最后进行外周血淋巴细胞增殖试验(MTT),并使用酶标仪检测OD值。

1.4.2 试验动物的饲养管理 试验兔采用笼养，人工饲喂，每日7:00和19:00分别饲喂适量添加了不同剂量的四君子散的自制颗粒饲料，自由饮水，采用自然光照，每天定时清粪、通风。

基础日粮参照NRC(1977)家兔饲养标准配制而成[4]，基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 试验基础日粮组成及其营养水平 (风干基础/%)

注：A：预混料为每千克饲粮提供The premix provides following per kilogram of diet：VA 8 000 IU；VD31 000 IU;VE 50 mg;Lys 1.59;Met 1.5 g;Cu 50 mg;Fe 100 mg;Mn 30 mg;Mg 150 mg;I 0.1 mg;Se 0.1 mg。B：营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values

1.4.3 测定指标和方法

1.4.3.1 生长性能的测定 每10 d测量1次兔体重，计算出平均日增重。饲养1个月后，计算平均日增重、料肉比等指标。

1.4.3.2 免疫器官指数的测定 放血解剖兔并摘取其免疫相关器官活组织，剔除脂肪和结缔组织，用滤纸吸去血渍，千分之一天平称重，计算免疫器官指数。

免疫器指数=免疫器官重量(g)/动物体重(kg)；胸腺指数=胸腺重(g)/体重(kg) ×1 000;脾脏指数=脾脏重(g)/体重(kg) ×1 000;圆小囊指数=圆小囊重(g)/体重(kg)×1 000;引突指数=引突重(g)/体重(kg)×1 000。

1.4.3.3 血浆中淋巴细胞增殖试验(MTT试验) 取1 mL新鲜抗凝血与全血及组织稀释液1∶1，混匀后小心加于等体积本分离液之液面上；以1 500 r/min离心15 min。此时离心管中由上至下细胞分4层，第1层是血浆层；第2层是为环状乳白色淋巴细胞层；第3层是透明的分离液层；第4层是红细胞层；收集第2层细胞放入含洗涤液(Hank′s液)4～5 mL的试管中，充分混匀后，以1 800 r/min离心20 min，弃去上清液留沉淀细胞重新悬起，重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。加入1 640培养液调整细胞浓度为1×106个/mL，接种入96孔板，每孔100 μL,每个样品重复8孔，同时加入用终浓度为10 μL/mL的ConA液刺激，另设细胞凋零孔。将细胞板放入5% CO2、37 ℃培养箱中培养48 h后，每孔避光条件下每孔加入20 μL MTT液，继续培养3 h后取出，每孔吸出上清液，加入100 μL裂解液，在微量震荡器上混匀使其颜色变澄清，用酶联免疫仪检测490 nm下的吸光度，作为淋巴细胞增殖的指标[5]。

2 试验结果

2.1 四君子散对兔子生产性能影响 见表2。

表2 四君子散对家兔生产性能的影响 (Means±SD,n=9)

从表2的数据结果分析，可以看出试验组与空白对照组进行单因素方差分析日增重和料肉比差异均不显著(P>0.05)，说明四君子散对家兔生产性能影响不明显。

2.2 四君子散对兔子免疫器官指数的影响 见表3。

表3 四君子散对兔子免疫器官指数的影响 (Means±SD,n=9)

从表3的数据结果分析，试验组兔的免疫器官指数高于空白对照组。试验组圆小囊和脾脏的免疫指数空白普遍高于空白对照组，但单因素方差分析差异不显著(P>0.05)。试验组圆小囊、胸腺、脾脏和引突的免疫指数在低剂量时都高于空白对照组，但差异不显著(P>0.05)。

2.3 血浆中淋巴细胞增殖试验(MTT试验) 见表4。

表4 血浆中淋巴细胞增殖试验(MTT试验)结果(OD值)(Means±SD,n=9)

注：同列肩注*表示差异显著(P<0.05)

从表4可以看出，试验组与对照空白组的淋巴细胞增殖情况比较，中剂量和高剂量均显著高于空白对照组(P<0.05)。说明中药四君子散添加剂可以显著促进外周血淋巴细胞增殖。

3 分析讨论

四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草组成，具有增强免疫功能、促进代谢、护肝、增强垂体一肾上腺皮质系统功能、抗肿瘤与抗突变、改善微循环、抗血小板聚集、延缓衰老、抗应激反应等作用[1]。目前四君子散在动物试验方向主要研究的是其对动物胃肠运动的调节，消化吸收功能的改善、新陈代谢的促进和免疫调节等。

试验发现，试验组与空白对照组进行单因素方差分析，日增重和料肉比差异不显著，说明四君子散对家兔生产性能影响不明显，在低、高剂量组与空白对照组的比较，日增重略有降低，料肉比略有上升。

免疫指数在一定程度上反映了动物的免疫功能，免疫指数越大，说明免疫性能越好[6]。而引突和圆小囊是兔子特有的免疫器官，引突位于盲肠的末端，圆小囊位于结肠和盲肠的交接处，同上这两个免疫器官指数在一定程度上也反映兔子的免疫功能，免疫指数越大，说明免疫性能越好。试验发现，试验组圆小囊、胸腺、脾脏和引突的免疫指数在低剂量时都高于空白对照组，但差异不显著。

T细胞和B细胞能特异性识别抗原，并能活化、增殖、分化，分别介导细胞免疫和体液免疫，T细胞和B细胞还可以进一步分为若干亚群，这些淋巴细胞及亚群在免疫应答过程中相互协作、相互制约，共同完成对抗原物质的识别、应答和清除，从而维持机体内环境的稳定[7]。淋巴细胞增殖能力的强弱，在某种程度上代表了淋巴细胞功能的高低，因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究的一种常用方法[8]。试验发现，试验组比空白对照组的淋巴细胞增殖数高，中剂量和高剂量组均显著提高 。说明中药四君子散添加剂可以显著促进外周血淋巴细胞增殖。

[1] 李玉,孙志阔,王希春，等.加味四君子汤对脾虚小鼠免疫机能应激和消化吸收的影响[J].中国畜牧兽医,2015,42(3):714-720.

[2] 魏彦明.四君子汤对家兔脾虚症调整作用的实验研究[J].甘肃农业大学学报,1997，32(3):261-266.

[3] 魏彦明,瞿自明.脾虚证模型家兔神经内分泌机能的变化及四君子汤对其调整作用[J].中国兽医学报, 1999，29(5):486-488

[4] 麻名文,李福昌.日粮精氨酸水平对断奶～2月龄肉兔生长性能、免疫器官指数及血清指标的影响[J]. 动物营养学报,2009,21(3):405-410.

[5] 陈红伟,李英伦,张志强,等.兔抗菌组蛋白对小白鼠生长和细胞免疫功能的影响[J].中国兽医学报,2014,34(5)：798-803

[6] 王宜强.浅论基础免疫学研究新进展对眼科免疫学研究的启示[J].中华实验眼科杂志,2014,32(7):577-582.

[7] 钱国英,陈永富.免疫学[M]. 杭州: 浙江大学出版社, 2010:286.

[8] 贾琳,郭斌. 萝藦多糖粗提物对免疫抑制小鼠免疫器官及淋巴细胞增值影响的初步研究[J]. 辽宁医学院学报，2011, 32(5): 400-402.

Effect ofSijunziPowder on immune organ index and lymphocyte proliferation in rabbits

WANG Yi-dong , WANG Dong-lin , FENG Tao , CHEN Hong-wei

(Department of Veterinary Medicine, Southwest University,Rongchang Campus, Chongqing 402460,China)

To study on the impact of sijunzi powder on the growth performance and immune function,36 45-day-old New Zealand weaned rabbits were randomly assigned to high, medium and low dose groups and blank control group,and 5%,3%,and 1% ofSijunziPowder added in the basic diet.The experimental time was one month,and the rabbits were weighed every 10 days Blood sampled were couected to carry out peripheral blood lymphocyte proliferation test at the last day of the experiment ,and at the same time,the immune organs were weighed. The results showed that the effect ofSijunziPowder on the production performance of rabbits was not obvious, but the middle dose group weight gain was increased by 0.74%,and the feed conversion ratio was decreased by 0.80%.We also found that it improved the immune organ index of rabbit sacculus rotundus and spleen, but there was no significant. The high dose group significance promoted the peripheral blood lymphocyte proliferation. It is concluded that theSijunziPowder has a promoting effect on the immune function of rabbits.

SijunziPowder ； Organ index ； MTT ； Rabbit

CHEN Hong-wei

2016-11-21

中央高校基本科研业务费专项(SWU114026,XDJK2016B010)；西南大学教育教学改革研究重点项目(2014JY096)

王毅东(1994-)，男，硕士生，研究方向为兽医免疫药理学，E-mail:chw80926@126.com

陈红伟，E-mail：chw80926@126.com

S853.72

A

0529-6005(2017)05-0061-03