头针电刺激百会与大椎穴对脑梗死大鼠MAP-2及Survivin的影响*

2017-06-21李晓宁单筱淳刘双岭

针灸临床杂志 2017年5期

关键词：头针神经细胞电针

李晓宁，吴磊，单筱淳，刘双岭，曹燚

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040)

头针电刺激百会与大椎穴对脑梗死大鼠MAP-2及Survivin的影响*

李晓宁1，吴磊2，单筱淳2，刘双岭1，曹燚1

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040)

目的：探讨头针电刺激对不同时间窗的脑梗死大鼠MAP-2及Survivin的影响。方法：将Wister雌性大鼠随机分为3组,给予相应造模方法，即头针电刺激组、模型对照组、假手术组，每组又分为7天组(15只大鼠)、14天组(15只大鼠)两个亚组。其中，头针电刺激组在造模术后24 h，针刺百会穴与大椎穴，将电针仪以密波参数为100 Hz进行电刺激，1次/日，30 min/次，余2组大鼠在每天相应时间固定于针刺平台，但不予任何处置。治疗7天与14天后，断头取脑。用Western blot技术检测梗死7天与14天脑组织中MAP-2及Survivin蛋白表达，测出蛋白表达相对值。结果：与同时段模型组比较，头针电刺激组7天、14天的MAP-2与Survivin蛋白表达明显增高，其中以14天时增高显著，差异具有统计学意义(P<0.05)；与同时段假手术组比较，头针电刺激组14天的MAP-2与Survivin蛋白表达增高，模型组7天、14天的MAP-2与Survivin蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：头针电刺激能提高MAP-2及Survivin 蛋白表达，保护受损神经细胞并促进受损细胞修护，抑制缺血区神经元的凋亡，促进血管再生，达到保护脑组织、恢复肢体功能作用，其中以头针电刺激组14天时疗效最佳。

脑梗死;头针;电刺激;MAP-2;Survivin

脑梗死在临床上常见的治疗方法，有改善脑部血液循环、营养脑细胞、促进代谢、中药治疗、手术治疗等，因难以阻止脑损伤或不能很好的促使受损脑组织再生，使其致残率很高，临床疗效不满意。目前临床上给予患者头部腧穴针刺配合电针仪治疗的效果已得到确实，世界医学也认可头针电刺激能降低脑梗死患者神经缺损功能的程度。因此，本研究在头穴电刺激治疗脑梗死的大量临床实践及科研实验基础上，通过建立急性脑梗死大鼠模型，观察Western blot技术检测梗死后7天与14天脑组织中MAP-2及Survivin 的蛋白表达，探讨其在脑梗死中可能发挥的神经细胞保护机制，为头针电刺激治疗本病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用健康Wistar大鼠，雌性，体质量(200±10)g，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。所有大鼠于实验前适应性饲养1周，然后根据随机数字表法将大鼠随机分为3组，分别为头针电刺激组、模型对照组和假手术组，各组又根据治疗时间窗的不同分为7天组与14天组两个亚组，每组15只。各组大鼠分别用苦味酸标记编号。

1.2 实验主要试剂与仪器

Super-GL ECL 超敏发光液 (诺伦生物)，裂解液(诺伦生物)，PVDF Transfer Membrane (Millipore)，HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (Jakeson)(抗体使用浓度1∶2000)，MAP-2(#8707,cellsignal) (抗体使用浓度1∶1000)，Survivin(#2808,cellsignal)(抗体使用浓度1∶1000)，PowerPacTMHC电泳仪 (bio-rad)，VE-180垂直电泳槽(天能)，Semi-Dry Transfer Cell (bio-rad) ，DY-B1脱色摇床(上海青浦沪西仪器)，KODAK X-Omat BT Film (Kodak)，华佗牌针灸针(15 mm 28号)，英迪牌电针仪 KWD-808-Ⅱ型，一端经石蜡制备后光滑的钓鱼线(长度约15 mm)。

1.3 实验模型制备

依据Longa[1]制定的大脑中动脉缺血模型，并根据课题组前期研究经验[2]制备MCAO大鼠模型。术前12 h各组大鼠禁食、不禁水，10%水合氯醛腹腔麻醉(300 ml/kg)。麻醉后将大鼠固定于手术台上，颈部去毛、消毒，在颈部正中行长约2 cm切口，用镊子和玻璃分针钝性分离皮下组织，暴露右侧颈动脉，找到颈动脉分叉处，将预先准备的3根手术线分别置于颈外动脉下、颈内动脉近心端及颈总动脉近心端，颈外动脉处手术线结扎，颈内动脉处手术线打一活结备用，然后用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉近心端，用剪刀在颈总动脉靠近分叉处剪一小口，迅速将预备好的鱼线插入动脉，分别经过颈总动脉、颈内动脉到达颅内，进入12 mm左右可感觉指下有阻力，此位置即为大脑中动脉处。然后扎紧手术线，将多余的鱼线减去，防止暴露在皮肤外。假手术组大鼠仅分离各动脉而不结扎插线。待大鼠苏醒后，进行Zea-longa 5级评分表进行行为学评分，纳入评分在1～3分大鼠。

1.4 治疗方法

头穴电刺激组：电针仪刺激选取的大椎与百会穴，将15 mm 28号毫针刺入穴位，接通电针仪正负两极，电针仪参数为密波100 Hz，每天1次，每次30 min，根据不同的治疗时间窗分别进行治疗；其余两组仅进行捆绑，其余不予任何处置。

1.5 Western blot检测MAP-2及Survivin蛋白表达

各组大鼠达到相应治疗时间窗后，分别进行行为学评分，然后断头处死，在预先准备好的冰盘上迅速取出大脑，装入冻存管中，放入液氮中冻存备用。Western blot 检测步骤：提取总蛋白、计算蛋白浓度、加入2×SDS-PAGE loading buffer蛋白上样缓冲液、100℃加热处理5 min变性、冰上冷却，样品使用10% SDS-PAGE分离，每孔上样量为20 ul、电泳(本实验使用Semi-Dry Cell进行半干电泳转移，转移条件为30 mA 60 min)、使用Blocking Buffer封闭转印膜4℃封闭过夜；依次加入稀释好的一抗与二抗(一抗与二抗均37℃温育2 h，1×TBST洗涤4次，10 min/次)，使用Super-GL ECL 进行化学发光检测，然后对X光片曝光。再进行显影定影处理，将胶片晾干，用凝胶成像分析系统拍照，使用Gel-Pro Analyzer软件分析处理。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 头针电刺激对脑梗死大鼠MAP-2蛋白表达的影响

Western blot结果显示假手术组MAP-2蛋白在脑梗死后7天与14天时表达相对值差异无统计学意义(P>0.05)。模型组MAP-2蛋白在脑梗死后7天与14天表达逐渐下调，且均低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。头针电刺激组MAP-2蛋白在梗死后7天与14天表达逐渐上调，与假手术组比较，14天的MAP-2蛋白表达相对值，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，7天与14天的MAP-2蛋白表达相对值，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

2.2 头针电刺激对脑梗死大鼠Survivin蛋白表达的影响

Western blot结果显示假手术组Survivin蛋白在脑梗死后7天与14天时表达相对值，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组Survivin蛋白在脑梗死后7天与14天表达相对值逐渐下调，且均低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)。头针电刺激组 Survivin蛋白在梗死后7天与14天表达相对值逐渐上调，与假手术组比较，14天的Survivin蛋白表达相对值，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，7天与14天的Survivin蛋白表达相对值，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

图1 不同样本MAP-2及Survivin的表达(GAPDH作为内参照)注：序号1～6分别表示头针电刺激7天组、模型7天组、假手术7天组、头针电刺激14天组、模型14天组和假手术14天组

图2 不同样本MAP-2及Survivin 的表达柱状图只/组)注：Western blot显示脑梗死大鼠在梗死后7天、14天时MAP-2与Survivin蛋白表达变化;序号1～6分别表示头针电刺激7天组、模型7天组、假手术7天组、头针电刺激14天组、模型14天组和假手术14天组

3 讨论

头针电刺激有助于神经细胞功能重塑，包括细胞功能可塑、细胞功能激活及功能保护。是以本实验通过检测MAP-2与Survivin的蛋白表达，探寻电刺激在脑梗死的治疗中分子学依据，寻求其在神经细胞中的保护机制。研究指出[3-4]，损伤神经的可塑性对于脑梗死后大脑功能恢复具有重要意义，MAP-2作为神经元树突生长的标志蛋白及神经元缺血损伤的敏感指标和早期标志，对大脑局部缺血缺氧的梗死显得尤为重要；MAP-2是目前研究最广泛的微管相关蛋白，其也是细胞骨架蛋白的重要成分，主要表达在神经元胞体、树突、树突棘和突触后致密区，主要作用可以是促进突起形成和维持神经元结构稳定性，并且对调节细胞骨架动态性变化，从而促进突触的可塑具有重要作用，因此MAP-2会影响神经元的生长和损伤后修复。龙建飞等[5]发现MAP-2可以促进脑损伤的恢复，并推测其机制可能是促进梗死灶周围皮层神经元树突生长与重塑、抑制星形胶质细胞过度活化，从而调节“神经元-胶质细胞网络”的功能。本实验中头针电刺激组MAP-2的表达要高于同时间点的模型对照组，以14天尤为明显；而与假手术组表达相当，14天要略高于假手术组。这说明电针使MAP-2表达增加，促进神经元损伤后修复，保护神经细胞，减轻脑组织的损伤，利于大脑功能恢复。

Survivin是至今发现的凋亡抑制蛋白家族中作用最强蛋白之一，在成人神经系统中主要表达于脉络丛室管膜细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[6]。脑梗死后神经细胞恢复和重建，依赖于神经元功能激活信号的传导，而电刺激通过蛋白表达诱导神经细胞产生新的与细胞凋亡有关的信号通路。作为Caspases唯一内源性抑制物的Survivin，能阻断诱导细胞凋亡的信号，主要是通过直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性实现的[7]。研究表明[8]，增加Survivin的表达可以下调Caspases的表达及其活性，降低细胞凋亡。且在新生血管形成过程中，实现维持血管稳定性、在血管分支和管腔形成方面不可或缺的血管生成素-1也需要增加Survivin的表达[7]。本研究的前期结果表明[9]，头针电刺激组的Caspases-3表达随时间而逐渐下降，模型对照组在梗死后7天时Caspases-3表达逐渐增加，随后在14天时略有下降；现今数据显示，头针电刺激组Survivin表达在7天与14天时间点是逐渐升高态势，模型对照组与此相反呈降低态势，这表明了某些因素，如电针，促使Survivin表达上调，结合凋亡蛋白抑制Caspases-3的活性，从而减少了细胞凋亡，保护了梗死脑组织的神经细胞。这与王宗立等[10-11]的研究结果基本相合。

综上所述可以看出，电针使MAP-2与Survivin表达增加，一方面促进神经元损伤后修复,另一方面结合Caspase-3移植细胞凋亡，共同起到保护神经细胞，减轻脑组织损伤，促使大脑神经功能恢复的作用，进而有利于梗死肢体康复。本研究初步解析了头电针在脑梗死中的作用机理，为头电针在以后临床实践中提供实验基础，也为电针在神经细胞中应用打下良好基础。

[1] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral Artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91

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黑龙江省自然科学基金面上项目,编号:H201466。