夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学的影响*

2017-06-21祝鹏宇孙颖哲孙远征赵广然刘彦麟

针灸临床杂志 2017年5期

关键词：运动神经元夹脊神经细胞

郭颖,祝鹏宇,孙颖哲,孙远征,赵广然,武丹,刘彦麟

(黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001)

夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学的影响*

郭颖,祝鹏宇,孙颖哲,孙远征△,赵广然,武丹,刘彦麟

(黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001)

目的：观察夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学的影响。方法：本实验以ALS-SOD1G93A转基因小鼠为实验对象，选用经PCR鉴定的ALS-SOD1G93A转基因小鼠24只，按照随机数字表法将小鼠随机分为电针组、手针组和模型组(均n=8只)，取同窝野生型小鼠8只作为阴性对照组。于小鼠日龄60天开始干预，电针组针刺双侧L1～2、L5～6夹脊穴，躯干同侧2 Hz电针治疗；手针组针刺双侧L1～2、L5～6夹脊穴；模型组予以捆绑固定,20 min/次，2次/周，共4周；阴性对照组不做任何处置。于小鼠日龄120天时取腰膨大组织进行HE染色和尼氏染色来观察各组小鼠腰髓前角运动神经元胞体及胞核的状态并对运动神经元进行计数，透射电镜观察腰髓前角神经元超微结构变化。结果：HE染色可见模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少，神经细胞结构不清、固缩，胞质胞核染色不清，核固缩，出现空泡状改变；与模型组比较，手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目增多，神经细胞结构形态有所改善，空泡化减少，且电针组效果优于手针组。尼氏染色可见模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少，非神经细胞增多，病变的神经元出现尼氏体不清，核固缩，细胞体积减小；与模型组比较，手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目增多，神经细胞结构形态有所改善，能够明显减轻运动神经元的丢失，且电针组效果优于手针组。运动神经元计数：模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少(P<0.01)；手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组增多(P<0.05或P<0.01)，且电针组较手针组增多更明显(P<0.05)。透射电镜可见模型组小鼠腰髓前角神经细胞萎缩，细胞膜皱缩，线粒体不同程度肿胀，嵴出现断裂、减少，有些线粒体虽可辨认，但已呈空泡状，核膜凹陷变形或部分破裂，异染色质聚集成块，变性的神经细胞周围可见胶质细胞围绕形成卫星现象；与模型组比较，手针组和电针组小鼠腰髓前角神经细胞超微结构有所改善，且电针组改善更明显。结论：夹脊电针能够改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学变化，其效果优于手针治疗。

夹脊;电针；ALS-SOD1G93A；尼氏染色；电镜

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是运动神经元病中最常见的一种类型，病变主要累及运动神经元而出现范围颇为广泛的肌肉无力、萎缩、肌束震颤，同时伴有锥体束征的一种神经系统变性疾病。该病起病隐袭，持续进展，预后不良，患者多在3～5年内死亡，患者及其家庭承受着巨大的痛苦和沉重的负担。因此，探讨ALS的发病机制及寻求有效的治疗方法一直是医学界关注、研究的热点和难点。

目前，现代医学治疗ALS的有效手段匮乏，利鲁唑(riluzole)是唯一被美国FDA批准的临床药物，该药可使ALS患者的生存期平均延长4～20个月，但却不能改善患者的症状或逆转进行性恶化的趋向[1]。而中医学对ALS发病的病因病机有独到认识，并在ALS治疗方面另辟蹊径，积累了大量的临床实践。经过不断探索研究，中药及针灸等多种治疗方法[2-8]被用于治疗ALS，已在改善患者临床症状和提高患者生活质量方面显示出明显优势。导师孙远征教授根据多年临床经验，采用夹脊电针治疗ALS患者，治疗两周即可明显改善患者肌无力症状[9]。基于临床研究结果，开展了基础实验研究，采用夹脊电针治疗ASL-SOD1G93A转基因小鼠，结果证实夹脊电针能够改善小鼠运动功能障碍，延缓其发病，延长生存期[10]。在前期研究中，已揭示夹脊电针治疗ALS的有效性，在本实验中，笔者进一步观察夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学的影响，为继续深入研究夹脊电针治疗ALS的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1 Gur小鼠和雌性 B6SJL/F1小鼠购于美国Jackson实验室(Bar Harbour，ME，USA)，于中国农业科学院哈尔滨兽医动物研究所恒温(22℃～27℃)、恒湿(40%～50%)、无特殊病原体(Specific pathogen free，SPF)环境中进行饲养繁殖，喂以灭菌水及颗粒型鼠类饲料。应用PCR鉴定子代鼠， SOD1-G93A基因阳性者用为模型动物，阴性者用为野生型对照小鼠。

1.2 动物分组

选用经PCR鉴定的ALS-SOD1G93A转基因小鼠24只，按照随机数字表法将小鼠随机分为电针组、手针组和模型组(均n=8只)。取同窝野生型小鼠8只作为阴性对照组。

1.3 各组处置

模型组：小鼠日龄60天开始，予以捆绑固定20 min，2次/周，共处置4周。

手针组：小鼠日龄60天开始，同模型组方法捆绑固定后，进行针刺干预，针刺穴位依据《实验动物针灸手册》进行定位。选用杏林牌针灸针0.17 mm×7 mm，针刺双侧L1～2、L5～6夹脊穴，进针4～5 mm，针刺后留针20 min，2次/周，共治疗4周。

电针组：小鼠日龄60天开始，同模型组方法捆绑固定后，与手针组相同方法针刺双侧L1～2、L5～6夹脊穴，针刺后将同一组导线的正负极连接至脊柱的同一侧，双侧导线分别连接后接入电麻仪，采用疏波(频率为2 Hz)，电流强度以小鼠下肢肌肉收缩为度，每次留针20 min，2次/周，共治疗4周。

阴性对照组：不做任何处置。

1.4 HE染色和尼氏染色观察腰髓前角运动神经元形态及计数

1.4.1 取材及操作针刺干预结束后，于小鼠日龄120天时取材进行相关检测。按照随机数字表法每组随机取6只小鼠，留取小鼠脊髓腰段，置于20 ml 4%多聚甲醛中固定，再切取腰膨大部位，石蜡包埋、切片、染色及封片后，光镜400倍下观察腰髓腰膨大前角运动神经元的形态学变化。

1.4.2 观察方法观察与判定:小鼠腰髓前角神经细胞结构形态是否正常，有无空泡形成，神经细胞胞质胞核染色是否均匀，细胞核形态是否正常，细胞核有无固缩。

计数:对连续切片的每第5张切片的脊髓前角运动神经元进行计数，每段腰膨大组织观察10个切片，取其均值作为每例平均每高倍视野内的运动神经元统计数据(个/HP)。HE染色识别神经细胞的标准为具有多极细胞体，颗粒状细胞质，有核仁，无论细胞大小均属神经元。尼氏染色识别神经细胞的标准为细胞核内有一个清晰的大核仁，周围为淡蓝染色的细胞质。

1.5 电镜观察腰髓前角运动神经元超微结构变化

取材及操作:针刺干预结束后，于小鼠日龄120天取材进行相关检测。按照随机数字表法每组随机取2只小鼠，留取小鼠脊髓腰膨大段，置于2.5%戊二醛中固定，修块、固定、丙酮梯度脱水、包埋、聚合、组织块的修整、半薄切片制备、超薄切片的定位、载网及3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，透射电镜下观察运动神经元的超微结构。

1.6 统计方法

2 实验结果

2.1 各组小鼠腰髓前角HE染色结果

2.1.1 各组小鼠腰髓前角运动神经元形态变化阴性对照组：小鼠腰髓前角运动神经元数目较多，神经细胞结构形态正常，轮廓清晰，无散在空泡形成，胞质胞核染色均匀，核仁清晰可见,见封三彩图1-a;模型组：小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少，神经细胞结构不清，固缩，胞质胞核染色不清，核固缩，出现空泡状改变,见封三彩图1-b;手针组：小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组多，神经细胞结构形态较模型组改善，部分神经细胞出现胞质胞核染色不清，空泡化较模型组少,见封三彩图1-c;电针组：小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组、手针组增多，神经细胞结构形态较模型组改善，部分神经细胞出现胞质胞核染色不清，空泡化明显减少,见封三彩图1-d。

2.1.2 各组小鼠腰髓前角运动神经元计数 HE染色结果显示，与阴性对照组比较，模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少(P<0.01)；手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组明显增多(P<0.05或P<0.01)，且电针组较手针组增多更明显(P<0.05)，见表1和图2。由此可知，手针和电针均可减轻腰髓前角运动神经元的丢失，且电针效果优于手针治疗。

表1 各组小鼠腰髓前角运动神经元计数比较±s,个/HP)

注：与阴性对照组比较，☆P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，△P<0.01；与手针组比较，**P<0.05

图2 各组小鼠腰髓前角运动神经元计数

2.2 各组小鼠腰髓前角尼氏染色结果

2.2.1 各组小鼠腰髓前角运动神经元形态变化阴性对照组：小鼠腰髓前角运动神经元数目较多，神经细胞结构形态正常，轮廓清晰，尼氏体、核仁清晰可见，无散在空泡形成,见封三彩图3-a;模型组：小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少，非神经细胞增多，神经细胞体积减小，尼氏体不清，核固缩，出现空泡状改变,见封三彩图3-b;手针组：小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组多，神经细胞结构形态较模型组改善，神经细胞体积减少，部分神经细胞出现尼氏体染色不清，空泡化较模型组少,见封三彩图3-c;电针组：小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组、手针组增多，神经细胞结构形态较模型组改善，部分神经细胞出现尼氏体染色不清，空泡化明显减少,见封三彩图3-d。

2.2.2 各组小鼠腰髓前角运动神经元计数尼氏染色结果显示，与阴性对照组比较，模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少(P<0.01)；手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组明显增多(P<0.05，P<0.01)，且电针组较手针组增多更明显(P<0.05)，见表2和图4。由此可知，手针和电针均可减轻腰髓前角运动神经元的丢失，且电针效果优于手针治疗。

表2 各组小鼠腰髓前角运动神经元计数比较±s,个/HP)

注：与阴性对照组比较，☆P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，△P<0.01；与手针组比较，**P<0.05

图4 各组小鼠腰髓前角运动神经元计数

图5 各组小鼠腰髓前角透射电镜结果

2.3 各组小鼠腰髓前角神经元超微结构观察结果

阴性对照组：神经细胞形态基本正常，胞质细胞器丰富、清晰，线粒体膜完整，嵴清晰，核膜完整，核内染色质分布均匀,见图5-a1、5-a2。

模型组：神经细胞萎缩，细胞膜皱缩，线粒体不同程度肿胀，嵴出现断裂、减少，有些线粒体虽可辨认，但已呈空泡状，核膜凹陷变形或部分破裂，异染色质聚集成块，变性的神经细胞周围可见胶质细胞围绕形成卫星现象,见图5-b1、5-b2。

手针组：神经细胞轻度萎缩，细胞膜皱缩，形态尚可，部分线粒体肿胀、嵴消失及空泡化，核膜不完整、内陷，染色质较不均匀，出现轻度聚集，见图5-c1、5-c2。

电针组：神经细胞形态尚可，线粒体轻度肿胀，部分嵴消失，空泡化减少，核膜虽有内陷，但结构较完整，核内染色质分布较均匀,见图5-d1、5-d2。

3 讨论

ALS-SOD1G93A转基因小鼠的主要病理学特征是腰髓前角运动神经元的变性、丢失，它的丢失表现为发病前的缓慢丢失和发病后的快速丢失，主要为腰髓和颈髓前角运动神经元丢失，而胸髓前角和各脊髓节段的后角及侧柱神经元则相对保留。至终末期，运动神经元丢失总数达70%以上[11-12]。

尼氏小体(Nissl’s Body,Nissl granules)作为神经细胞的特征性结构之一，又称为虎斑样物质，是指神经细胞中特异性嗜碱性颗粒群，呈粒状、微粒状或虎斑状，存在于神经元除轴突和轴丘以外的胞浆中，是粗面内质网核糖体中的核蛋白，化学本质是核糖核酸及蛋白质，它的功能与神经元的功能具有非常密切的关系，常作为判断神经细胞存活的标志。因此，通过尼氏染色观察尼氏小体的变化可以反映神经细胞发生的病理生理变化。而运动神经元计数无疑是评价ALS-SOD1G93A转基因小鼠疾病进展最可靠和最客观的指标。

本实验中，笔者采用HE染色和焦油紫尼氏染色观察了各组小鼠日龄120天时腰髓前角运动神经元的形态变化并对运动神经元进行计数。HE染色结果可见，模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少，神经细胞结构不清，固缩，胞质胞核染色不清，核固缩，出现空泡状改变，定量分析发现较阴性对照组运动神经元数目下降了50%，手针组小鼠运动神经元数目下降32%，电针组小鼠运动神经元数目下降14%；尼氏染色结果可见，模型组小鼠腰髓前角运动神经元总数明显减少，非神经元细胞增多，病变的神经元出现尼氏体不清，核固缩，细胞体积减小，定量分析发现较阴性对照组运动神经元数目下降了59%，手针组小鼠运动神经元数目下降41%，电针组小鼠运动神经元数目下降21%，HE染色和尼氏染色结果具有一致性，均提示手针和电针治疗减缓了腰髓前角运动神经元的丢失，且电针效果优于手针。同时通过透射电镜观察了各组小鼠腰髓前角运动神经元的超微结构变化。结果证实夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角神经元形态学病变有改善作用，保护神经细胞，从而改善小鼠的运动功能障碍，延缓发病，延长生存期。基于前期实验的结果，接下来的实验将致力于开展夹脊电针干预ALS-SOD1G93A转基因小鼠有效性机制方面的研究，为夹脊电针向临床推广提供更加可靠的实验依据。

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Effect of Electroacupuncture at Jiaji Points(EX-B2)on Morphology of Lumbar SpinalAnterior Horn Neurons in the Transgenic Mice with Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS)

GUO Ying,ZHU Peng-yu,SUN Ying-zhe,SUN Yuan-zheng△,ZHAO Guang-ran,WU Dan,Liu Yan-lin

(TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective：To observe the effect of electroacupuncture at Jiaji point (EX-B2) on morphology of lumbar spinal anterior horn neurons in the transgenic mice with ALS. Methods：24 ALS-SOD1G93Atransgenic mice were randomly divided into three even groups, that is electroacupuncture (group E), acupuncture group(group A) and model group(group M). Eight non-transgenic littermates were assigned to blank group(group B). Interventions to ALS-SOD1G93Atransgenic mice began from their age of 60 days. Group E was treated by electroacupuncture at Jiaji points (EX-B2), with the electrical stimulation at the frequency of 2 Hz. The four-week intervention was 20 minutes per time and twice a week. Group A was only treated by acupuncture at Jiaji points (EX-B2) and group C was disposed by firm binding. None intervention was given to group B. At the age of 120 days, HE staining, Nissl staining and transmission electron microscopy were used to ALS-SOD1G93Atransgenic mice to observe the anterior horn of the lumbar spinal cord pathological morphology, and detect the amount of motor neurons.Results：Analysis from HE staining, Nissl staining and transmission electron microscopy showed that group E and group A could significantly reduce morphological lesions and increase the amount of motor neurons compared with group C(P<0.05 orP<0.01), and group E was better than group C. Conclusion：Electroacupuncture at Jiaji points(EX-B2) can improve morphological changes of motor neurons in the anterior horn of the lumbar spinal cord in ALS-SOD1G93Atransgenic mice, which is better than by manual acupuncture.

Jiaji points(EX-B2);Electroacupuncture;AlS-SOD1G93A;Nissl staining;Electron microscopy