不同核酸检测方法对献血者隐匿性乙肝病毒感染的分析

陈秀丽

[摘要] 目的 分析不同核酸检测方法对献血者隐匿性乙肝病毒感染的检测能力。方法 方便抽取2015年1月—2016年10月期间到献血站进行无偿献血的8 000名人员，对其分别选择Procleix Ultrio以及nested-PCR两种自动核算检测系统对其血浆标本予以HBN核酸检测，同时序列分析核酸阳性标本。结果 通过研究后可知，40名献血者HBsAg检测结果为阳性，比例经计算后为0.50%，420名献血者抗-HBc结果为阳性，比例经计算后为5.25%，25例献血者经过Procleix Ultrio以及nested-PCR能力相当，表现为阳性结果。结论 献血人员中隐匿性乙肝病毒感染比例较高，而核酸检测方法的差异性致使检测能力有所不同。

[关键词] 核酸检测；献血者；隐匿性乙肝病毒感染

[中图分类号] R440 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）04（c）-0068-03

[Abstract] Objective To analyze the effect of different nucleic acid test methods on the occult hepatitis B virus infection of blood donors. Methods 8 000 cases of blood donors from January 2015 to October 2016 were extracted and the plasma specimens were given the HBN nucleic acid test respectively by the Procleix Ultrio and nested-PCR， at the same time， the nucleic acid positive samples were given the sequence analysis. Results The research showed that of the 40 blood donors， the HBsAg test result was positive accounting for 0.50%， of 420 cases of blood donors， the anti-HBC result was positive， accounting for 5.25%， the result of Procleix Ultrio was similar to that of nested-PCR， positive. Conclusion The ratio of occult hepatitis B virus infection of blood donors is higher， and the difference in the nucleic acid test method lead to different test abilities.

[Key words] Nucleic acid test； Blood donor； Occult hepatitis B virus infection

HBV感染是我国较为重要的公共卫生课题，而检测HBV感染的主要指标为HBsAg。然而在排除早期感染检测窗口期，而经过HBV DNA阳性比例均有隐匿性HBV感染引发HBsAg阴性结果。HBV感染的一种特殊类型为OBI，如果献血者出现OBI，当其进行献血时会使得受血者产生病毒性肝炎或者感染HBV[1]。临床对于OBI的检测并无良好的手段，通常选择NAT（核酸检测）对HBV DNA进行检测。核算检测方法则在PCR原理基础上以及TMA原理基础上，上述两种原理均可对HIV、HCV以及HBV病毒进行检测[2]。该次研究则分析同核酸检测方法对献血者隐匿性乙肝病毒感染的检测能力，方便抽取2015年1月—2016年10月期间到献血者进行无偿献血的8 000名人员，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便抽取2015年1月—2016年10月期间到献血者进行无偿献血的8 000名人员，对其血浆标本进行抽取，每人需要将2管血浆标本进行保留，两管均为8 mL真空采血管，具有EDTA-K2抗凝以及带分离胶，同时型号为LOT N786502。一管进行Procleix Ultrio检测，另外一个管首先将1 mL血浆进行分离，在-20℃环境中进行保存，随后对其进行nested-PCR检测。剩余标本进行血清学检测。

1.2 方法

血清学检测。8 000名献血人员在进行献血之前需要实施HBsAg试纸条初次筛选，为HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）诊断，随后对此标本实施检测，其检测内容包含HBsAb、HBsAg以及HbcAb，此試剂采用胶体金法进行检测。采用北京万泰生物药业股份有限公司生产的检测剂HBsAb和HbcA，采用美国雅培以及厦门新创生产的HBsAg试剂，此试剂采用ELISA方法进行检测。上述试剂均进行批检同时按照试剂盒操作说明书予以操作。HBsAg阴性结果为两种HBsAg试剂经检测后均为阴性，任何一种HBsAg检测为阳性则说明HBsAg结果阳性[3]。

Procleix Ultrio检测。Procleix Ultrio检测选择单人份核算检查，随后和血清学检测一同进行。Ultrio在进行初检的过程中，如果出现反应性标本需要进行重复检测，如再次产生反应性则为Ultrio反应性，如对其实施重复检测后无反应性，通过辫子血血浆进行检测，如依旧未产生反应性则为Ultrio非反应性，再次予以检测后可将其判定为Ultrio反应性。因为Procleix Ultrio检测能够对HIV、HVC、以及HBV混合病毒进行检测，为此Ultrio 反应行标本需要实施HBV鉴别，从而对其是否为阳性结果进行确定[4]。

nested-PCR检测。nested-PCR检测则是按照抗-HBc阳性单独标本实施检测，检测过程中为单人份HBV-nested-PCR检测。Procleix Ultrio检测 NAT结果如果为阳性，其标本并非是抗-HBc单独阳性，随后对其实施单人份HBV-nested-PCR检测[5]。血浆检测时，选择QIAamp DNA Blood Mini Kit对HBV-DNA进行检测，检测过程中选择6套不同地区的引物实施巢式PCR，20 copies/mL为巢式PCR检测指标。如果进行初次检测后其标本结果为阳性，对其标本进行保存，并对DNA标本进行重复提取，进而实施复检，当复检结果为阳性时其检测结果为阳性，当复检结果为阴性时检测结果为阴性[6]。

1.3 HBV S基因片段测试

S基因区域中的a表位片段是采用ABI 3 100 DNA全自动测试予以检查，a表位片段包含aa110-aa165。在进行检测的过程中其引物为S3 GCGGGGTTTTCTTGTTGAC 以及S4 GGGACTCAAGATGTTGTACAG，通过检测可知其序列长度大致为544bp，同时表现为双向[7-8]。基因分型则选择MEFA3.1序列软件实施，随后采用Neighbor-Join-ing对数据进行计算。

2 结果

2.1 分析献血人员一般情况和血清学检测结果

8 000名献血人员男性4 500名，女性3 500名，年龄最大者为38岁，年龄最小者为21岁，经软件计算后平均年龄为（31.4±2.0）岁，3 000名为初次献血。通过检测后可知40名献血者HBsAg检测结果为阳性，比例经计算后为0.50%，420名献血者抗-HBc结果为阳性，比例经计算后为5.25%。

2.2 分析HBV核酸检测结果

40名献血者为阳性结果，而25例献血者经过Procleix Ultrio以及nested-PCR能力相当，表现为阳性结果，详细数据由表1可知。与此同时，20名献血者为B型基因，6名献血者为C型基因，其中OBI中5名为B基因，10名为C基因。

3 讨论

无偿献血人员中通常会产生OBI现象，而此现象同样在多数研究中进行报道。同时该地区采用抗-HBc单独阳性结果联合nested-PCR方法对无偿献血者进行检测[9]。而该次研究结果表明，本地区无偿献血患者中具有较高的隐匿性乙肝病毒感染发生率，而将血液筛选方法进行有效改进，保证血液安全是临床一直研究的课题。与此同时说明nested-PCR为核酸检测方法的灵敏度以及稳定性良好，但是因为此方法操作过程中具有一定的复杂性，因此不能将此方法在临床中进行常规应用。

Procleix Ultrio为目前临床中常用的血液核酸筛查系统，我国部分供血机构均采用此系统对NAT进行检测，临床研究证实nested-PCR检测方法的灵敏度高于Procleix Ultrio检测，对其原因因素进行分析可能为以下几点，两种检测方法的原理存在差异行，nested-PCR为一种方法，而Procleix Ultrio采用TMA原理，为此前者检测方法的灵敏度高于后者，但是需要进行深度研究，此外Procleix Ultrio系统对于HBV核酸并无较高的灵敏度。通常情况下，隐匿性乙肝病毒感染载量在200 IU以下，Procleix Ultrio虽然可实现几个IU，但是其自身的灵敏度存在差异性，同时因为环境、标本和操作等相关因素的影响，无法实现检测水平，进而降低了检出正确率。

该次研究通过探究后可知，40名献血者HBsAg检测结果为阳性，比例经计算后为0.50%，420名献血者抗-HBc结果为阳性，比例经计算后为5.25%，25名献血者经过Procleix Ultrio以及nested-PCR能力相当，表现为阳性结果。由此能够看出不同核酸检测方法对献血者隐匿性乙肝病毒感染具有不同的临床意义，此研究结果和临床以往的研究结果存在一致性，和李锦等人[10]对隐匿性乙肝献血者中TGF-β1的表达结果存在相似性，其研究结果证实C型极易产生OBI患者。

综上所述，C型极易产生OBI，但是由于该次研究时间以及样本数量等问题，对于OBI的产生机制还需要进一步研究。

[参考文献]

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[3] 蒋昵真，朱绍汶，汤心怡，等.256例ELISA筛查无反应性/核酸检测反应性标本的确认分析[J].中国输血杂志，2016，29（10）：1126-1129.

[4] 方娱.HBsAg阴性伴抗--HBC阳性人群隐匿性乙型肝炎病毒感染流行率及临床特征研究[D].济南：山东大学，2016.

[5] 吕豪，江素君，孙爱华，等.衢州市无偿献血者中隐匿性HBV感染的基因型别及突变类型分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，2014，28（5）：371-373.

[6] 叶贤林，杜鹏，冯旭，等.深圳市18～25歲抗-HBc阳性合格献血者隐匿性乙肝病毒感染的血清学和分子生物学特性分析[C]//中国输血协会.2014中国输血协会第七届输血大会论文集.北京：中国输血杂志，2014： 1112-1116.

[7] 贾晓坤，贾晓晖，杨鹏华，等.张家口地区献血者隐匿性乙肝病毒感染研究[J].现代生物医学进展，2013，13（10）：1962-1964.

[8] 孙波.输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析的研究[D].济南：山东大学，2013.

[9] Kaneva， E.，Rainova， I.，Harizanov， R，et al.Study of Toxocara seroprevalence among patients with allergy and healthy individuals in Bulgaria[J].Parasite Immunology，2015，37（10）：505-509.

[10] 李锦，景媛媛，郭燕，等.隐匿性乙肝献血者中TGF-β1的表达分析[J].中国输血杂志，2016，29（1）：39-41.

（收稿日期：2017-01-24）