中荷64杨组织培养快繁技术研究

2017-06-19矫丽曼纪纯阳杨成超

辽宁林业科技 2017年3期

关键词：中荷中国林业叶柄

矫丽曼，纪纯阳，杨成超

（辽宁省杨树研究所，辽宁盖州115213）

中荷64杨组织培养快繁技术研究

矫丽曼，纪纯阳，杨成超

（辽宁省杨树研究所，辽宁盖州115213）

以中荷64杨叶柄为外植体，通过对比试验确定中荷64杨组织快繁体系。结果表明：愈伤组织诱导与继代培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂5 g·L-1；不定芽分化与继代培养基为MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂5 g·L-1；生根培养基为1/2MS+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂5 g·L-1，将组培苗进行了移栽，成活率90%以上，为中荷64杨的推广和应用提供了保障。

中荷64杨；外植体；快繁

中荷64杨Populus×canadensis‘N3016’又名荷兰3016杨，是由荷兰森林及城市研究所选育出来的雌株，其母本为美洲黑杨，父本是欧洲黑杨。1982年由中国林业科学研究院林业研究所引进我国[1]。树干通直饱满，树形美观，速生性、抗寒性较强，在内蒙古、新疆部分地区生长良好，在辽宁中南部广泛栽培[2]。但其抗盐碱能力稍差，从而限制了该品种的推广应用。本文建立了中荷64杨组织培养快速繁殖体系，为该杨树品种的广泛推广、分子及抗性的研究提供了前期试验基础，为获得杨树优良新品种提供保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中荷64杨枝条采自辽宁省杨树研究所锦州市金城苗圃。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌材料的获得[3-4]

剪取1年生中荷64杨健壮枝条，长100 cm左右，放入装有水的坛子中，于室内进行水培，2～3 d换1次水，保持水的清洁。待芽开放展叶后，剪取1 cm幼嫩叶柄，用流水冲洗干净后，在超净工作台内用70%酒精浸泡30 s进行表面灭菌，期间轻轻摇晃三角瓶，无菌水冲洗3次，每次3 min，再用0.1%升汞灭菌5 min，期间轻轻摇晃三角瓶，最后用无菌水冲洗5次，每次3 min，沥干水分后获得无菌外植体。

1.2.2 愈伤组织的诱导与继代培养[5-6]

以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和2,4-D，蔗糖20 g·L-1、琼脂5 g·L-1，将无菌外植体分别接种于不同的培养基中诱导与继代培养。每个处理接种15个叶柄。

1.2.3 不定芽的分化与继代培养[7-9]

以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，添加蔗糖30 g·L-1，琼脂5 g·L-1，将愈伤组织分割成1 cm3的小块转入不同的不定芽分化培养基中分化与继代培养。每个处理接种18块愈伤组织。

1.2.4 不定芽的生根培养[10-11]

以1/2MS为基本培养基，加入不同浓度的IBA，添加蔗糖20 g·L-1，琼脂5 g·L-1，将长2 cm以上的不定芽从基部切下，接种于不同的培养基中生根培养。每个处理接种21个不定芽。

1.2.5 培养条件[12]

以上培养基pH值均为5.6。培养温度（25±1）℃，光照强度2 000 lx，每天光照13 h。

1.2.6 组培生根苗的容器移栽[13]

移栽前打开三角瓶上的封口膜，炼苗1～2 d。选择根系发达、苗高5 cm以上的组培苗，用温水小心洗去附着在组培苗根部的培养基，剪去较长的根系，移栽到营养杯中，基质为大田土、腐殖土、河沙按1∶1∶1比例混合，经高压灭菌后使用。

1.2.7 大田移栽

育苗地应选择疏松、排水透气性良好，易于灌溉的壤土或沙壤土为好，移栽前进行整地、做床，选择苗高15 cm以上的容器生根苗进行移栽。殖，体积膨大，呈扇面状。通过筛选确定最佳的诱导培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1，诱导48 h，诱导率100%，愈伤组织生长快，很大，呈嫩绿色（表1）。

图1 叶柄膨大

2 结果与分析

2.1 培养基的筛选

2.1.1 愈伤组织诱导与继代培养基的确定

接种2 d后，叶柄两端膨大（图1），叶柄逐渐肿胀伸长，6 d后叶柄表面形成淡黄色的愈伤组织（图2）。培养4周左右挑选黄绿色、松脆的愈伤组织转入该培养基中继代培养，转接后的愈伤组织不断增

图2 愈伤组织形成

表1 叶柄在不同培养基上的分化与继代情况

2.1.2 不定芽分化与继代培养基的确定

9 d后愈伤组织上分化出绿色的小芽点，15 d后分化出大量浓密的丛生芽（图3）。培养4周后，将分化出的不定芽转到该培养基中继代培养诱导其抽茎展叶。通过筛选确定最佳的增殖培养基为MS+ 6-BA0.1 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1，开始分化时间是11 d，平均分化芽15.8个，不定芽分化率100%，不定芽多且大，呈嫩绿色（表2）。

表2 不定芽在不同培养基上的分化与继代情况

图3 不定芽的分化培养

表3 不定芽在不同培养基上的生根情况

2.1.3 生根培养

6 d后，从无根苗基部长出粉红色毛状根（图4），向四周辐射生长，根长0.5～2.0 cm，根较粗壮，同时苗也逐渐长高长壮。通过筛选确定最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.2 mg·L-1，开始生根时间是8 d，生根的不定芽数21个，平均生根数13.5个，生根率100%，不定芽根多、粗且长、基部有很多愈伤组织（表3）。

2.2 容器移栽

移栽时为使苗根均匀分布于营养杯中，并与土壤紧密接触，将土装到距营养杯口1 cm为好，利于保水。用遮阳网遮光保湿，在保证空气相对湿度80%～95%的同时，还要保证土壤含水量70%左右，以免小苗根部腐烂死亡。遮阳时间应视季节和天气条件而定，短期遮阳后，小苗逐渐适应外界环境[13]。

2.3 大田移栽

移栽前1周灌足底水，保证小苗移栽时水分的供应，移栽时间为7、8月份，在阴天或傍晚进行移栽，选择苗高15 cm以上的容器生根苗移栽，去掉营养杯，带营养土栽植于圃地中，栽后立即浇水。

3 结论与讨论

植物组织培养中，生长素用来诱导细胞和根的分化，而细胞分裂素用来促进细胞分化和不定芽的分化，对根的分化具有抑制作用[14]。

通过比较分析确立了中荷64杨组织培养最佳配方，愈伤组织诱导与继代培养基：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂5 g·L-1，pH值5.6。不定芽分化与继代培养基：MS+ 6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂5 g·L-1，pH值5.6。生根培养基：1/2MS+ IBA0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂5 g·L-1，pH值5.6。

不定芽的分化培养采用了6-BA和NAA来诱导，不定芽的再生频率较高，同时6-BA/NAA的比值对不定芽分化的影响也较大，当6-BA/NAA≤10时，会促进不定芽的分化；6-BA/NAA>10时，会抑制不定芽的分化。本研究选取的比值为5，有利于不定芽的分化，可以提高不定芽的分化率。生根培养基采用1/2MS培养基，培养基中无机盐减半会促进不定根的发育，同时IBA的浓度也会影响根细胞的分化，低浓度适宜根细胞的分化，较高浓度的IBA会对根的分化产生胁迫，阻碍根的生成。

容器移栽生根苗，选择的营养杯大小要适中，过小不利于根的伸展，过大杯内装土过多，含水量大，根易腐烂，同时大田土、腐殖土、河沙三者比例要适宜。栽培初期水分不宜过大，浇透水后，雾面喷洒即可。大田移栽时要选择通风良好的地块，如果地表土不松软，可以掺一些腐殖土。苗生长期要勤观察，发现病虫害要采取有效的措施及时防治。

［1］王胜东，杨志岩.辽宁杨树［M］.北京：中国林业出版社，2006.

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