野外采集和人工饲养胭脂鱼耳石微结构特征分析

雷毅， 周宇， 杨坤， 武佳韵， 张修月， 宋昭彬, 3*

(1. 四川大学生命科学学院，四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都610064； 2. 四川农业大学生命科学学院，四川雅安625014； 3. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610064)

野外采集和人工饲养胭脂鱼耳石微结构特征分析

雷毅1， 周宇1， 杨坤1， 武佳韵2， 张修月1， 宋昭彬1, 3*

(1. 四川大学生命科学学院，四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都610064； 2. 四川农业大学生命科学学院，四川雅安625014； 3. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610064)

分别检测了人工饲养和野外采集胭脂鱼Myxocyprinusasiaticus耳石微结构特征。根据透明性的差异，可将耳石划分出暗区和亮区两部分，63.16%人工饲养胭脂鱼的耳石具有明显的亮暗区界限，暗区大小为0.17 mm±0.03 mm；14.81%野外采集胭脂鱼的耳石亮暗区界限清晰，大部分亮暗区界限模糊或没有亮暗区差异，暗区大小为0.14 mm±0.06 mm。人工饲养和野外采集胭脂鱼耳石中心核直径分别为13.10 μm±1.87 μm和11.14 μm±1.74 μm，原基个数分别为1个和1～2个。人工饲养胭脂鱼耳石标记轮1～3条，生长轮宽度为2.14 μm±0.59 μm，宽度均匀，波动幅度小；野外采集个体耳石标记轮1～7条，生长轮宽度为2.54 μm±1.12 μm，波动幅度相对较大。生长轮宽度聚类分析表明，在欧氏距离为2.5处可将94.59%的人工饲养胭脂鱼耳石聚在一起，聚类结果与微结构特征检测结果基本吻合。人工饲养与野外采集胭脂鱼耳石的亮暗区、生长轮宽度、标记轮等微结构特征差异明显，可用于两者的识别。

胭脂鱼； 野外采集； 人工饲养； 耳石微结构； 群体识别

胭脂鱼Myxocyprinusasiaticus(Bleeker)属鲤形目Cypriniformes亚口鱼科Catostostomidae胭脂鱼属Myxocyprinus(丁瑞华，1994)，其生长快、个体大、肉味鲜美，且具有较高的观赏价值，是我国传统的名贵经济鱼类之一(祝东梅等，2013；Chuetal.，2016)。该物种曾在长江和闽江广泛分布，且产量较大(陈春娜，2008；Chengetal.，2013)。受水利工程修建、过度捕捞、水体污染等影响，闽江的胭脂鱼已几近绝迹，长江中的分布区也逐渐缩小，已被列为国家Ⅱ级重点保护水生野生动物(张春光等，2000；Lietal.，2013)。胭脂鱼自然种群数量锐减，人工增殖放流是保护和恢复其资源的重要途径(武佳韵等，2014)。然而，胭脂鱼放流时大多数个体未被标记，无法准确识别放流和野生个体，势必影响胭脂鱼放流效果的评估。因此，建立准确、有效的个体识别方法尤为重要。

在鱼体的各种器官组织中，耳石的结构与组成成分相当稳定，能记录鱼类生长和发育中所经历的一些重要事件，如初次摄食、变态、定居、栖息地改变及生存环境的突然变化等(Johetal.，2011；黎雨轩等，2013；李凤莹等，2014)。自Pannella(1971)首次报道鱼类耳石日轮后，耳石微结构的研究引起了国内外学者的浓厚兴趣并不断发展起来，耳石日轮已在海、淡水硬骨鱼类中得到普遍证实(Dingetal.，2015；Cardosoetal.，2016)。如今，耳石微结构的检测与分析已成为鱼类生态学及渔业生物学研究中一项重要而公认的技术，为准确研究鱼类的种群生态学特征提供了新途径，同时还有助于建立识别鱼类种群的新方法。有研究表明，生存环境条件的差异，如食物、昼夜温差、竞争压力等，可能影响耳石微结构的式型，使鱼类耳石微结构表现出一定的差异，可用于群体的鉴别(Johetal.，2011；Pecketal.，2015)。许多研究通过对耳石微结构的检测和分析，也都实现了对鱼类不同群体的识别(Paragamianetal.，1992；Hendricks & Torsello，1994；宋昭彬等，2003a；Yamadaetal.，2009)。然而，人工饲养和野生胭脂鱼耳石微结构是否存在可用于两者识别的差异，尚未见报道。

本研究对野外采集和人工饲养胭脂鱼耳石微结构进行检测和分析，旨在找出人工饲养和野生胭脂鱼耳石微结构的稳定差异，从而有效地区分人工饲养和野生胭脂鱼，为人工放流群体的识别、放流效果的评估等提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料采集

野外胭脂鱼样本分别采自重庆市万州长江江段(2007—2013年，体长5.57～17.55 cm，体质量2.8～89.8 g)、木洞长江江段(2013年，体长5.1～15.1 cm，体质量2.0～53.4 g)、泸州-合江长江江段(2012年，体长11.2～31.9 cm，体质量31.2～682.3 g)和宜宾市长江江段(2013—2015年，体长4.4～6.2 cm，体质量1.76～5.76 g)。人工饲养胭脂鱼样本分别采自四川省农业科学院水产研究所(2012年，体长6.12～13.12 cm，体质量5.0～36.1 g)、重庆市万州水产研究所(2013年，体长11.4～16.2 cm，体质量30～85.6 g)和宜宾珍稀水陆生动物研究所(2013年，体长11.8～19.9 cm，体质量26.4～146.2 g)。

1.2 耳石的摘取和磨片制备

用剪刀剪开胭脂鱼脑颅骨，将左、右耳石取出，经无水乙醇清洗后晾干，分别保存于1.5 mL离心管中。选取左耳石，用Krazy glue固定于载玻片上，依次用800#、1200#和1500#水磨砂纸沿耳石矢切面打磨，打磨过程中不断在显微镜下检查，直至打磨到生长中心。然后将耳石翻面，用同样的方法打磨另一面。打磨完成后，加热使Krazy glue熔化，取下耳石用无水乙醇清洗、二甲苯透明后，中性树脂封片保存，以备耳石微结构检测。

1.3 检测、拍照

在NIKON YZ2光学显微镜下镜检耳石微结构特征，统计原基个数和标记轮条数。用CANON US 60B数码相机和OLYMPUS BX43显微镜组成的照相系统对耳石磨片拍照。使用计算机辅助图像分析系统(宋昭彬，2000)测量耳石中心核大小，当耳石形状呈圆形时，测量直径，否则测量长径；测量耳石原基至标记轮的距离；测量沿耳石短径方向的暗区半径和从距耳石原基100 μm处开始的20个连续生长轮宽度(图1)。

1.4 数据处理与分析

用Excel 10.0和Graph Pad Prism 5.0进行数据统计和分析。以20个连续生长轮宽度为指标，用SPSS 19.0进行聚类分析。借助Adobe Photoshop CS6对图片进行编辑处理。

图1 胭脂鱼耳石生长轮的测量

a. 矢状面全貌(R. 生长轮测量方向)， b. 生长轮宽度的测量。

a. whole section of the sagittal plane (R. the direction of the measurement)， b. measurement of the daily increments.

2 结果

2.1 人工饲养胭脂鱼耳石微结构特征

根据耳石矢切面上透明度和光密度的差异，可将人工饲养胭脂鱼耳石大致划分出暗区和亮区。入射光下，暗区颜色深，亮区颜色较浅；反射光下，暗区不透明，亮区透明度较高(图版Ⅰ：1,2)。耳石亮暗区透明度差异较大，两区交替处可观察出明显的颜色差异，63.16%的耳石(n=57)能够看出两区分界(图版Ⅰ：1,2,6)，暗区大小为0.17 mm±0.03 mm。

胭脂鱼耳石磨片上具有一圆形或椭圆形的生长中心，为耳石中心核(图版Ⅰ：1,3)，人工饲养胭脂鱼耳石中心核直径为13.10 μm±1.87 μm (n=83)；其内深黑色的圆形、卵圆形或椭圆形结构为耳石原基，所检测的人工饲养胭脂鱼耳石(n=64)均表现为1中心核1原基。耳石中心核周围明暗相间的环纹构成生长轮。人工饲养胭脂鱼耳石生长轮较均匀(图版Ⅰ：6,9)，宽度为2.14 μm±0.59 μm，波动幅度为0.49～4.74 μm(n=43)(图2)。少数生长轮颜色很深、宽度较宽，显著区别于其他生长轮，为标记轮(图版Ⅰ：10)。人工饲养胭脂鱼耳石上通常具有1条、2条或3条标记轮，所占比例分别为48.98%、35.71%和6.12%(n=98)，各标记轮在耳石上的位置较稳定，分别为10.57～13.48 μm、25.49～38.07 μm、36.74～56.83 μm。

2.2 野外采集胭脂鱼耳石微结构特征

野外采集胭脂鱼耳石同样可以划分出亮区和暗区(图版Ⅰ：3，4)，但仅14.81%耳石(n=81)的亮暗区分界明显，耳石暗区大小为0.14 mm±0.06 mm；56.79%的耳石除具有明显的中央暗区和外部亮区外，两者之间有一个过渡区域(图版Ⅰ：4，10)；28.39%的耳石无明显的亮暗区差别(图版Ⅰ：5)。

野外采集胭脂鱼耳石中心核直径为11.14 μm ±1.74 μm(n=85)，大多数耳石(86.42%)为1中心核1原基，少数耳石为1中心核2原基。生长轮宽度为2.54 μm±1.12 μm，波动较大(图版Ⅰ：7，8)，幅度为0.51～12.13 μm(n=23)(图2)。标记轮数量为1～7条，所占比例依次为4.65%、8.14%、27.91%、25.58%、16.28%、5.81%和3.49%(n=86)，标记轮在耳石上的位置不固定。

图2 人工饲养和野外采集胭脂鱼耳石上部分生长轮宽度比较

对野外采集胭脂鱼耳石微结构的检测发现，23.45%的耳石(n=81)中间部分微结构特征更多地与人工饲养胭脂鱼耳石微结构特征相符，耳石的亮暗区分界明显，暗区大小为0.15 mm±0.02 mm(图3：a)；耳石中心为1中心核1原基，中心核大小为12.81 μm±1.04 μm(图3：b)；生长轮均匀，宽度为2.09 μm±0.96 μm，波动幅度0.57～6.74 μm，耳石中间部分的生长轮相对清晰，耳石外缘部分则相对模糊(图3：c)。这些个体可能是被误捕的人工放流胭脂鱼。

2.3 欧氏聚类

以20个连续生长轮宽度为指标进行聚类分析，结果表明，在欧氏距离为2.5处可将94.59%的人工饲养胭脂鱼耳石(n=37)聚在一起(类群Ⅰ)，同时，类群Ⅰ中还包含42.11%的野外采集胭脂鱼耳石(n=57)(图4)，依据人工饲养和野生胭脂鱼耳石微结构特征的差别，对此部分耳石的微结构特征进行复核，有9颗耳石的微结构特征与野生胭脂鱼耳石微结构特征相符，余下耳石均检测到人工饲养胭脂鱼耳石的典型特征，包含了78.95%的通过耳石微结构特征检测被判定为人工放流胭脂鱼的耳石。对未能聚到类群Ⅰ中的人工饲养胭脂鱼耳石(MR-17和MR-14)的轮纹宽度、亮暗区、标记轮等耳石微结构特征进行检测，其多数结构特征与人工饲养胭脂鱼耳石微结构特征相吻合，可能为聚类误差。

图版Ⅰ 胭脂鱼耳石矢切面磨片

1, 2, 6, 9. 人工饲养胭脂鱼耳石； 3, 4, 5, 8, 10. 野外采集胭脂鱼耳石； 1～4. 解剖镜； 5～10. 显微镜； 1, 3. 入射光； 2, 4. 反射光； N. 中心核, ODZ. 暗区, LODZ. 亮区； ▶. 标记轮。

1, 2, 6, 9. sagittal section of otoliths from hatchery-breedingM.asiaticus； 3, 4, 5, 8, 10. sagittal section of otoliths from wild-caughtM.asiaticus； 1-4. dissecting microscope； 5-10. compound microscope； 1, 3. incident light； 2, 4. reflected light； N. nucleus, ODZ. optically dense zone, LODZ. low optically dense zone； ▶. check.

图3 野外采集胭脂鱼中可能为放流胭脂鱼的耳石

Fig. 3Myxocyprinusasiaticusconfirmed to be originated from stocking enhancement

ODZ. 暗区, LODZ. 亮区, N. 中心核, P. 耳石原基。

ODZ. optically dense zone, LODZ. low optically dense zone； N. nucleus； P. primordium.

3 讨论

鱼类的耳石随着鱼体的生长而不断生长，生长轮的形态也会发生相应的改变，由最初正圆形的同心圆轮到最后稳定变成一端稍尖的心梨形或长圆形，其圆心位于偏近圆的一端，形成长、短径，通常短径生长轮排列紧密，长径生长轮较稀疏。不同鱼类耳石长、短径的生长轮清晰度不一，故生长轮计数、间距测量应根据不同鱼类的实际情况而定(Campanaetal.，1994；解玉浩，1995)。鱼类耳石在长径和短径方向上，沉积速率较为稳定，都能反映耳石的生长轮特性(管兴华，曹文宣，2007)。对胭脂鱼耳石生长轮的检测发现，长径上生长轮稀疏且多有混乱不清区段，短径上生长轮密集且清晰，多数耳石靠近耳石中心的生长轮清晰度较弱，可能由以下原因引起：第一，耳石自身发育使生长轮比较微弱。昼夜温差可以影响生长轮的清晰度和对比度，而在温度恒定或昼夜温差不大的条件下，沉积的生长轮通常不清晰，且分界线不明显(Campana，1984；Neilson & Geen，1985；Bestgen & Bundy，1998；宋昭彬等，2003)。第二，显微聚焦观察、拍照时，耳石上的生长轮难以在全视野下清晰观察。这种情况在稍大耳石的观察中尤为明显，因为焦平面上微小的差异，可使靠近耳石边缘的增量变得重叠或完全消失；或可使生长轮一部分清晰，一部分模糊；还可使轮纹有明显移动(王菲等，2010)。第三，耳石打磨过程中，部分生长轮被磨损。在本研究中，野外采集胭脂鱼群体可能存在放流个体，为了能够尽可能保证对放流胭脂鱼群体进行识别，作者认为，对生长轮宽度的测量，应从距耳石中心核最近且生长轮清晰的区域开始。

图4 胭脂鱼耳石生长轮宽度的聚类分析

Fig. 4 Clustering analysis based on the otolith ofMyxocyprinusasiaticus

MR. 人工饲养胭脂鱼, MW. 野外采集胭脂鱼。

MR. hatchery-breedingM.asiaticus, MW. wild-caughtM.asiaticus.

鱼类耳石生长轮具有日沉积现象，可用于年龄的估计、推算孵化日期和生长率等(Chenetal.，2011；Liuetal.，2013)。同时，鱼类在生活史中所经历的特殊事件也会通过影响生长轮的沉积规律等方式被记录(史方等，2006；刘伟等，2013)。水温和食物是影响鱼类耳石生长轮沉积规律的2个主要因素，不同生长条件下，耳石生长轮宽度和规则性表现出较大差异(Yukamietal.，2008；Parkinsonetal.，2012)。付自东(2006)和Song等(2009)的研究表明，饲养水温越高，胭脂鱼的耳石生长轮越宽；饥饿组和摄食组仔鱼间耳石生长轮宽度存在明显差异。Hendricks和Torsello(1994)对美洲西鲱Alosasapidissima的研究表明，受生长慢及孵化场饲养条件稳定的影响，孵化场饲养的个体耳石生长轮窄，放流到野外后，生长轮宽度增加。当鱼类从一个栖息地向另一个栖息地迁移时，由于不同环境中水温和食物丰度的差异，耳石生长轮宽度也会随之发生变化(Andrewsetal.，2012；Takahashietal.，2014)。本研究发现，胭脂鱼在人工饲养和野外条件下耳石生长轮宽度存在差异，人工饲养胭脂鱼耳石生长轮较窄且均匀，波动幅度较小，而野生个体生长轮宽度波动幅度较大，差异的形成可能也与生长期总体的水温和食物有关。饲养条件下，胭脂鱼一般在3月—4月初进行人工催产，而野外的繁殖时间为3—4月，且多数个体在4月繁殖。人工饲养胭脂鱼对应的水温相对偏低，导致其耳石生长轮宽度比野生个体窄。值得注意的是，在饲养条件下，水温的波动相对于野外环境中的小，可能是造成野生个体的耳石生长轮波动幅度较大的原因；同时，饲养条件下，食物充足且稳定，而野外条件下的营养条件可能不稳定，也可能是影响耳石生长轮宽度及其规则性的另一因素。

本研究发现，胭脂鱼耳石上表现出透明性的差异，即亮区和暗区的存在，这与管兴华和曹文宣(2007)、陆化杰等(2012)、刘必林等(2016)在其他鱼类中的研究结果相似。Morris和Aldrich(1985)研究认为，耳石透明性的差异主要受温度和食物影响，春、夏季鱼类活动力较强，新陈代谢旺盛，沉积钙离子的速率快且沉积量较多，在光学显微镜下呈现亮带；而秋、冬季鱼类新陈代谢率降低，沉积在耳石中的碳酸钙含量相应减少，有机质所占比例提高，在光学显微镜下呈现暗带。宋昭彬等(2003b)对草鱼Ctenopharyngodonidellus的研究表明，受不同月份平均水温的影响，耳石上表现出显著的透明性差异。Volk等(1990)也认为，突然降低水温，可使大麻哈鱼Oncorhynchusketa的耳石上形成暗带，饥饿则使大鳞大麻哈鱼O.tschawytscha的耳石上形成透明性相对较高的环带。胭脂鱼耳石上出现透明性的差异可能也与生活环境中的平均水温有关，即四季平均水温的差异导致了耳石上亮区和暗区的差异。同时，人工饲养胭脂鱼相比于野生胭脂鱼更早进行繁殖，由于水深和人为因素的影响，饲养环境下水温的波动较野外条件下的相对小；而长江水温在2—4月一般会以一个基本稳定的速率开始逐步回升，但总体水温都维持在较低水平，5月开始，长江水温上升较快，由20 ℃左右上升至年均最高水温28～33 ℃(宋昭彬，2000；孙大明等，2010)。因此，人工饲养条件下的胭脂鱼一般会经历更长时间的较低温生长，这也与本研究所得出的人工饲养胭脂鱼耳石暗区大于野生胭脂鱼的结果相符。

有研究表明，人工饲养条件下的个体摄食条件好且环境条件稳定，而野生个体要忍受食物量的变化及生存条件的波动，两者在耳石微结构上表现出一些特有的差异，通过对耳石微结构的分析，可以对饲养和野生种群进行区分(Zhangetal.，1995；Wilson & McCormick，1999；Morales-Ninetal.，2005)。宋昭彬等(2003a)对人工饲养和野生草鱼耳石微结构的研究也指出，由于饲养和天然条件下食物和温度等差异，两者的亮暗区特征，生长轮的清晰度、宽度和对比度等耳石微结构特征存在明显差异，可用于不同群体的识别。本研究发现，人工饲养和野生胭脂鱼耳石微结构特征也存在同样较为稳定的差异。通过对野外误捕、人工饲养胭脂鱼耳石微结构特征的系统检测与分析，利用饲养和野生胭脂鱼种群的耳石微结构特征差异，可以识别人工饲养、野生和人工放流胭脂鱼。进行识别时，可以参考以下特征：(1)亮暗区的表现形式；(2)生长轮宽度及波动幅度；(3)标记轮的数量及在耳石上形成位置的稳定性；(4)中心核的大小及原基个数。但仅通过观察耳石微结构特征进行群体识别又具有一定局限性，只能做出经验性总结和判断。依据耳石生长轮宽度对耳石进行聚类分析，得出了同检测耳石微结构特征较为一致的分类结果，经检验，聚类分析具备一定的可信度。因此，将耳石微结构特征与生长轮宽度欧式聚类分析相结合，可更加客观、准确识别人工饲养和野生胭脂鱼群体。

致谢：本研究得到了四川省农业科学院水产研究所、重庆市万州水产研究所、宜宾珍稀水陆生动物研究所和何学福教授在胭脂鱼样本收集中给予的帮助，在此表示感谢。同时，感谢四川大学生命科学学院林玉成老师在耳石照片的拍摄过程中给予的指导和帮助。

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Otolith Microstructure Character Analysis between Wild-caught and Hatchery-breedingMyxocyprinusasiaticus

LEI Yi1, ZHOU Yu1, YANG Kun1, WU Jiayun2, ZHANG Xiuyue1, SONG Zhaobin1, 3*

(1. Sichuan Key Laboratory of Conservation Biology on Endangered Wildlife, College of Life Sciences, Sichuan University,Chengdu 610064, China； 2. College of Life Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan Province 625014, China；3. Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education, College of Life Sciences,Sichuan University, Chengdu 610064, China)

The otolith microstructure of hatchery-breeding and wild-caughtMyxocyprinusasiaticuswere examined and analyzed. The otoliths ofM.asiaticuscould be divided into optically dense and low optically dense zones based on the difference of transparence. The otoliths, which had distinct boundary between the optically dense and low optically dense zones, accounted for 63.16% in hatchery-breeding population and 14.81% in wild-caught. The size of optically dense zones in otolith of wild and captiveM.asiaticuswas 0.14 mm±0.06 mm and 0.17 mm±0.03 mm, respectively. Otolith nucleus diameter of hatchery-breeding and wild-caught was13.10 μm±1.87 μm and 11.14 μm±1.74 μm, respectively, and the primordium was 1 and 1-2, respectively. The number of checks was 1-3, and the width of daily increment was 2.14 μm±0.59 μm in the otolith of hatchery-breedingM.asiaticus. However, otoliths of wild-caughtM.asiaticusshaped 1-7 checks and the width of daily increment was 2.54 μm±1.12 μm. Otoliths of hatchery-breedingM.asiaticushad more regular and smaller fluctuant width of daily increment compared with that of wild-caught individuals. The result of clustering analysis based on daily increment suggested that, 94.59% of otoliths from hatchery-breedingM.asiaticuswere clustered together at the Euclidean distance of 2.5, and this was consistent with the result of microstructure examination. In conclusion, the otolith microstructure of hatchery-breeding and wild-caughtM.asiaticuswere remarkably differed such as the optically dense and low optically dense zones, the width of the daily increment and the number of the checks, and these differences could be used to determine the source ofM.asiaticus.

Myxocyprinusasiaticus； wild-caught； hatchery-breeding； otolith microstructure； stock discrimination

2017-01-16 接受日期：2017-03-14

中国长江三峡集团有限公司科研项目(0799531)

雷毅(1989—)， 男， 硕士研究生， 研究方向：动物分子生物学， E-mail：leiyi_scu@126.com

*通信作者Corresponding author， 教授， 博士生导师， E-mail：zbsong@scu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170018

Q959.4

A

1000-7083(2017)03-0285-08