菜瓜蔓枯病苗期抗性鉴定方法比较

姚协丰，徐锦华，李苹芳，张曼，任润生，刘广，羊杏平

（江苏省高效园艺作物遗传改良重点试验室·江苏省农业科学院蔬菜研究所南京210014）

菜瓜蔓枯病苗期抗性鉴定方法比较

姚协丰，徐锦华，李苹芳，张曼，任润生，刘广，羊杏平

（江苏省高效园艺作物遗传改良重点试验室·江苏省农业科学院蔬菜研究所南京210014）

以不同菜瓜为试验材料，采用室内苗期活体接种和离体叶片接种2种方法，研究42份菜瓜材料对蔓枯病的抗性，分析离体叶片菌丝块接种的菌丝侵染扩展半径（lesion radius）与苗期活体接种发病情况相关性，比较不同菜瓜对蔓枯病抗性的差异，筛选优质的抗蔓枯病菜瓜资源。结果表明，离体叶片菌丝块接种的菌丝侵染扩展半径与苗期活体接种平均病情级别数的相关性达到0.906（P≤0.05），同时筛选出10份对蔓枯病具有中等抗性的菜瓜材料。

菜瓜；苗期；瓜类蔓枯病；抗性鉴定

瓜类蔓枯病（gummy stem blight）是由亚隔孢壳属瓜类黑腐球壳菌[Didymella bryoniae(Auersw.) Rehm]引起的真菌性病害，是影响瓜类生产的重要病害之一。该菌寄主范围广，可以侵染甜瓜、西瓜、黄瓜、南瓜等多种作物，侵染植株的叶片、茎蔓和果实等部位，主要危害茎部皮层组织，致使整个植株枯萎而死亡[1-2]。目前保护地栽培的高温、高湿条件利于蔓枯病发病，品种单一加上常年连作并伴随病菌量加大、农业生态条件恶化，导致瓜类蔓枯病成为瓜类生产中发生最普遍、危害最严重病害之一[3]，一般病田减产20%～30%，严重可达80%[4]。

国内对瓜类蔓枯病的研究主要集中在甜瓜、黄瓜、西瓜等作物[4-7]，对菜瓜蔓枯病目前还未有系统研究。菜瓜（Cucumis melo L.var.conomon Thunberg）为葫芦科甜瓜属甜瓜种越瓜变种，原产东亚（中国江浙一带）和南亚（印度）。中国民间又称为梢瓜，印度也称为酸瓜（acidulus）。各地地方品种有：‘花皮梢瓜’（浙江杭州、海宁）、‘长度白瓜’（广东）、‘青皮菜瓜’（合肥）、‘八棱瓜’（河北青县）、‘酥菜瓜’（河南驻马店）[8]。

目前针对瓜类蔓枯病的防治以化学药剂为主，长期使用化学农药极易使病原菌产生抗性，导致环境污染并威胁人类健康，而一些高毒农药的限制使用，使瓜类蔓枯病防治成为生产上的防治重点和难点[9]，因此防治瓜类蔓枯病最根本、最环保高效的方法就是选育品质优良的抗病品种[2,10]。开展对现有种质资源抗性鉴定是抗病育种的关键，但是目前国内尚未有系统开展菜瓜抗蔓枯病的研究，菜瓜种质资源抗蔓枯病能力尚不十分清楚。为此，研究菜瓜种质资源对蔓枯病抗性的鉴定评价体系、筛选抗性强的菜瓜种质资源，对于克服或减轻蔓枯病对菜瓜的危害，以及利用抗性材料培育抗蔓枯病的菜瓜品种，具有重要的理论意义和实践价值。笔者通过对菜瓜种质资源进行苗期蔓枯病的接种鉴定，筛选出了优良的抗性资源，以期为菜瓜蔓枯病抗性遗传改良及新品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

供试42份菜瓜材料由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供，材料名称和来源见表1。菜瓜材料分为自交系和杂交1代。其中自交系20份，杂交1 代22份。接种所用蔓枯病菌[Didymella bryoniae (Auersw.)Rehm]菌株在田间病株收集、分离，并作致病性鉴定，确定蔓枯病菌株DBJSJY2作为强致病力和稳定性好的抗病性接种鉴定菌株。育苗基质为江苏省农业科学院配制的育苗土，灭菌处理后备用。

表1供试菜瓜材料名称与来源

1.2蔓枯病菌培养及产孢

参照Li等[11]方法诱导培养蔓枯病菌产分生孢子：选取DBJSJY2的纯性培养物，接种试验前将DBJSJY2接种于PDA固体培养基（200 g土豆，20 g葡萄糖，15 g琼脂，补足1 L水)，26～28℃培养1周。选取新鲜无伤口的黄瓜，经过灭菌蒸馏水冲洗干净后，用75%酒精擦拭表面，晾干后，用直径0.7 cm的灭菌打孔器切取菌块，灭菌刀片在黄瓜表面上轻微打去表皮，挑取培养菌株的菌丝块置于上面，放入培养箱，28℃培养，5～7 d后产生分生孢子，用刀片刮取，研磨，然后用4层纱布过滤，在显微镜下用血小球计数板计数，用于接种的菌液浓度配制成5×105个·mL-1的孢子悬浮液。

1.3室内苗期抗性鉴定

接种方法参照Zhang等[12]的方法，在菜瓜苗期植株展开第3～第4片真叶时，用微型喷雾器将配制好的5×105个·mL-1孢子悬浮液（加1%Tween 80）喷到植株叶片开始滴水为止。接种后用塑料拱棚保湿，保持相对湿度90%以上，3 d后揭开小拱棚，10 d时调查统计病情。叶片侵染分级标准参考如下，0级：无可见侵染；1级：老叶上边缘坏死或斑点＜10 mm，新叶无病；2级：老叶上边缘坏死或斑点＜10 mm，新叶边缘坏死；3级：所有叶均有感染，叶坏死面积＜25%；4级：25%＜叶坏死面积≤50%；5级：叶坏死面积＞50%。平均病情级别数计算公式：RI=Σ（级值×株数）/总株数[10,12]。根据平均病情级别数（RI）确定蔓枯病抗性级别，高抗（HR）：RI＜1.0，抗（R）：1.0≤RI＜2.0，中抗（MR）：2.0≤RI＜3.0，感病（S）：3.0≤RI＜4.0，高感（HS）：RI≥4.0。

1.4离体叶片菌丝块接种

选取DBJSJY2的纯性培养物，接种试验前将DBJSJY2接种于PDA固体培养基，26～28℃培养1周。离体叶片菌丝块接种方法参照Wang等[13]方法稍做修改：取菜瓜植株展开的第3～第4片幼叶，用灭菌蒸馏水冲洗干净，晾干后置于灭菌的铺有滤纸的培养皿中。将0.5 cm的灭菌打孔器制作的菌丝块置于菜瓜叶片上，每个叶片接2个菌丝块，然后把培养皿放在光照培养箱中保存，培养条件为：温度（26±1）℃，光照周期16 h光照/8 h黑暗，相对湿度约90%。每个处理3片叶，3次重复，5 d后测量菌丝块周围的菌丝侵染扩展半径（lesion radius），根据扩展半径分析菜瓜材料对病原菌的敏感性。比较离体叶片菌丝块接种的菌丝侵染扩展半径与活体接种鉴定后平均病情级别数的相关性。

1.5数据分析

采用SAS 8.0统计软件对试验数据进行方差分析和皮尔逊(Pearson)相关性分析,以P≤0.05为差异统计学意义。

2 结果与分析

2.1苗期活体接种鉴定不同菜瓜材料的抗病性

对42份菜瓜材料采用喷雾接种方法鉴定了它们对蔓枯病菌的抗性反应。供试42份材料接种3～5 d后均开始发病，叶部出现蔓枯病早期典型症状，呈现褪绿病斑，病斑逐渐扩大并扩展为“V”型病斑，材料间发病程度不同，总体没有发现免疫或高抗材料，未接种对照均未发病。由表2、表3可知，10份菜瓜材料发病相对较轻，表现为中抗，其平均病情级别数在2～3，占总数的23.8%，其中自交系材料6份，杂交材料4份；表现感病的材料有10份，平均病情级别数在3.6～3.9，占总数23.8%；其余材料均表现为高感，平均病情级别数均超过4，表现对蔓枯病较为敏感。

表2不同菜瓜材料苗期对蔓枯病抗性鉴定结果

表342份菜瓜材料对蔓枯病的抗性评价

2.2离体叶片菌丝块接种与苗期活体接种鉴定比较分析

对42份菜瓜材料采用离体叶片菌丝块接种方法鉴定其对蔓枯病菌的抗性反应。供试42份材料接种菌丝块后，周围均有菌丝侵染扩展，材料间菌丝侵染扩展范围大小差异显著，扩展半径从1.70 cm 到4.02 cm不等。其中10份苗期活体接种鉴定表现为中等抗性的越瓜材料侵染扩展半径均小于3 cm，其他32份感病和高感菜瓜材料扩展半径均大于3 cm（表2）。另外，离体叶片菌丝块接种菌丝侵染扩展半径与活体接种鉴定后平均病情级别数的相关性程度较高，扩展半径与平均病情级别数的相关系数达到0.906。

3 讨论

本研究结果显示，所有菜瓜材料地方品种均不同程度地感染蔓枯病，未发现对蔓枯病免疫的种质资源。10份材料对蔓枯病有一定抗性，根据平均病情级别数进行鉴定，仅达到中抗水平。一般情况下，由于人工接种方法创造的发病条件极为适宜，苗期人工接种发病程度往往会高于田间自然发病过程[14]，因此苗期人工接种可能会使试材更容易发病，导致高抗材料抗性被低估。所以，可通过室内鉴定方法快速大批量初步筛选抗性资源，但要更精确地进行抗性鉴定还需田间抗性与苗期人工接种结合。由初步筛选结果可见，现有的部分菜瓜种质资源蕴藏着有价值的抗性基因资源，对其鉴定可为今后蔓枯病抗病基因鉴定利用、抗病性状分子关联分析、抗蔓枯病菜瓜品种的选育和遗传改良奠定基础。

离体叶片接种法，可以提高接种筛选的数量，简单易行、周期短、效率高、环境因素可控、可重复性高，不影响筛选材料进一步生长[15]，所以目前离体叶片接种法被广泛应用于品种的蔓枯病抗性鉴定中。但是现有的离体叶片接种方法基本采用与苗期活体接种一致的孢子喷雾接种和病情统计方法，这使得离体叶片接种的发病情况往往比苗期活体接种的严重，病情级别也偏重[16-17]。所以在离体叶片接种方法中选择更为合适的接种体（孢子、菌丝、菌块等）和病情分级方法值得研究。笔者尝试进行了离体叶片菌丝块接种与苗期活体接种鉴定初步比较，应用菌丝侵染扩展半径作为供试菜瓜材料对蔓枯病敏感性指标，发现离体叶片菌丝块接种菌丝侵染扩展半径一定程度上与苗期活体接种结果相对应，呈现显著正相关，离体叶片接种病斑扩展与苗期活体接种平均病情级别数的相关性达到0.906（P≤0.05）。张永兵等[16]采用离体和活体苗期接种2种鉴定方法鉴定甜瓜蔓枯病时，发现2种鉴定方法的发病率和病情指数都呈正相关，并且病情指数相关性较高，笔者采用离体叶片接种方法和苗期活体接种方法相关性结果与此结果一致。另外，离体叶片菌丝块接种及菌丝侵染扩展半径统计方法已有应用于豆类褐斑病品种抗性鉴定的报道[13,18]。所以，下一步可以研究细化菌丝侵染扩展半径系数分级，以此为筛选鉴定菜瓜材料对抗蔓枯病抗性的依据。但是，本试验中离体叶片菌丝块接种方法鉴定品种对蔓枯病抗性的结果只是初步的，菌丝块侵染扩展半径反应的品种对蔓枯病敏感性与抗病性是否与传统抗病鉴定方法的抗性级别一一对应，以及是否真实反映田间抗性还有待进一步验证。

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Comparison of different identifying methods for oriental pickling melon （Cucumis melo var.conomon）resistance to Didymella bryoniae at the seedling stage

YAO Xiefeng,XU Jinhua,LI Pingfang,ZHANG Man,REN Runsheng,LIU Guang,YANG Xingping

(Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement,Institute of Vegetable Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014,Jiangsu,China)

Taking 42 different varieties of oriental pickling melons as materials,using the spray inoculation method at seedling stage and detached leaf inoculation,the resistance to Didymella bryoniae of the oriental pickling melons were studied.The results showed that 10 acceesions were moderate resistant and no one immune.In addition,significant positive correlations were observed between the lesion radii of detached leaf assay and the results by spray inoculation at seedling stage.

Oriental pickling melon;Seedling stage;Gummy stem blight;Disease resistance identification

2016-09-18；

：2016-12-15

江苏省农业科技自主创新基金项目[CX(13)2001]；国家西甜瓜产业技术体系（CARS-No.8）

姚协丰，男，助理研究员，主要从事西瓜甜瓜抗病育种研究。Tel:025-84390731；E-mail:yaoxiefeng@jaas.ac.cn

羊杏平，男，研究员，主要从事西瓜甜瓜育种与生物技术研究。Tel:025-84390222；E-mail:1394654153@qq.com