母胎界面维生素D受体表达与复发性自然流产相关及可能的机制

闫春芳，闫晓婷，惠凌云，王 丽，白 娥，于学文

(1.西安市第四医院生殖中心，陕西 西安710004；2.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安710061)

母胎界面维生素D受体表达与复发性自然流产相关及可能的机制

闫春芳1，闫晓婷2，惠凌云2，王 丽2，白 娥2，于学文2

(1.西安市第四医院生殖中心，陕西 西安710004；2.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安710061)

目的 探讨母胎界面维生素D受体(VDR)表达与复发性自然流产及胎盘激素的关系。方法 2014年7月至2014年9月在西安交通大学第一附属医院妇产科门诊收集复发性流产患者和正常早孕妇女绒毛和蜕膜组织，采用荧光实时定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测两组绒毛组织和蜕膜组织中VDR及绒毛膜促性腺激素受体、雌激素受体和孕激素受体mRNA的含量，比较两组表达的差异。结果 复发性流产组绒毛组织中VDR、绒毛膜促性腺激素受体、雌激素受体mRNA相对水平低于对照组(t值分别为4.86、6.16、2.39，均P<0.05)；绒毛膜促性腺激素受体和雌激素受体mRNA的表达水平与VDR表达水平明显正相关(F=10.21，P=0.01；F=14.52，P=0.00)。复发性流产组蜕膜组织中VDR、绒毛膜促性腺激素受体、雌激素受体mRNA相对水平也低于对照组(t值分别为5.28、2.34、2.60，均P<0.05)。结论 母胎界面VDR mRNA表达水平与早期自然流产相关，绒毛组织绒毛膜促性腺激素受体和雌激素受体mRNA的表达水平与VDR表达水平有一定的相关性。但是VDR导致自然流产的机制仍需进一步研究。

复发性自然流产；维生素D受体；母胎界面；绒毛膜促性腺激素受体；雌激素受体

自然流产是妊娠早期常见的并发症之一，其病因复杂，除遗传、生殖道解剖、内分泌、感染、创伤、免疫等明确原因外，仍有大约50%原因不明[1]，因此对其治疗也存在一定局限性和有效性。近年来，有研究发现维生素D作为一种免疫调节剂，除具有经典的钙磷调节作用之外，其非经典的免疫调节作用也越来越受到重视，如维生素D缺乏与类风湿关节炎[2]、系统性红斑狼疮[3]等相关。随着维生素 D受体(vitamin D receptor，VDR)在胎盘、子宫等女性生殖系统的发现，维生素D对妊娠期胚胎植入、细胞因子的合成和感染等过程的免疫调节，以及维持成功妊娠的相关研究也越来越多。但对于早期复发性自然流产(recurrent miscarriage，RM)患者中维生素D的改变仍不明确，因此本研究探讨了母胎界面绒毛组织VDR转录水平的表达与RM及胎盘激素受体(包括绒毛膜促性腺激素受体、雌激素受体及孕激素受体)的相关性。

1材料和方法

1.1材料

2014年7月至2014年9月在西安交通大学第一附属医院妇产科门诊收集早期复发性自然流产和同期早期正常妊娠要求行人工流产者的绒毛和蜕膜组织各8份，早期复发性自然流产样本作为复发性流产组(RM)，早期正常妊娠要求行人工流产样本作为对照组。复发性流产组平均孕周54.38±2.67天，对照组平均孕周51.50±2.98天，两组比较差异无统计学意义(t=2.034，P=0.061)。复发性流产组均至少有2次早期自然流产史，无活产史；无甲状腺功能异常及糖尿病等自身免疫性疾病，无高血压等全身性慢性疾病；生殖系统的解剖结构未见异常；自身免疫抗体检测阴性及凝血相关检查正常；夫妇双方的染色体分析结果正常；无生殖道感染；弓形虫、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒IgM检查结果阴性；叶酸代谢率及同型半胱氨酸检测结果正常。对照组均至少有一次活产史，未发生过任何不良产史；本次孕期未出现过腹痛、阴道出血等先兆流产的症状。本研究的标本采集均征得研究对象本人的同意，并获得西安交通大学第一附属医院伦理委员会的批准。

1.2方法

1.2.1绒毛和蜕膜组织标本的收集

收集刮宫后绒毛和蜕膜组织，用高压灭菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)反复漂洗，洗至无明显血液残留，吸干水分，将绒毛和蜕膜组织分装在冻存管中，液氮速冻5～10min，转移至-80℃冰箱保存备用，避免反复冻融。

1.2.2荧光实时定量PCR

将绒毛和蜕膜组织各50mg，经漂洗、剪碎后，加入500μL裂解液反复吹打，之后4℃，12 000rpm离心5 min，吸取上清液到1.5mL EP管中；加入等体积的70%乙醇混匀，将混合液全部转入到RNA Spin Column中，12 000rpm离心1 min，弃滤液；先后将500μL和600μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12 000 rpm离心30s，弃滤液；将RNA Spin Column安置于1.5mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入70μL的RNase Free dH2O，室温静置5min，4℃，12 000rpm×2 min离心，洗脱RNA，即为所得RNA。利用Takara公司的反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，按试剂盒说明书进行(cDNA逆转录聚合酶连反应试剂盒，TaKaRa公司)。以制备的cDNA为扩增模板进行荧光实时定量PCR(fluorescence real-time quantitative PCR, FQ-PCR)反应，总反应体系25μL，39个循环(荧光实时定量PCR试剂盒，TaKaRa公司)。反应完成后，吸取混匀后的PCR产物5μL加入凝胶孔中，电压90V，电泳30min，之后将凝胶放置在凝胶图像处理系统中，观察PCR产物片段大小。按照公式F=2-△△CT，计算样本中目的基因 mRNA 的相对表达量。

根据GenBank上所查 mRNA序列，设计了VDR、绒毛膜促性腺激素受体(human chorionic gonadotropin receptor，hCGR)、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)引物，引物序列见表1。

表1 FQ-PCR引物序列

1.3统计学方法

2结果

2.1绒毛组织VDR及胎盘激素受体的表达

复发性流产组绒毛组织VDR、hCGR及ER表达明显低于对照组(t值分别为4.86、6.16、2.39，均P<0.05)，而PR两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 复发流产组与对照组绒毛组织VDR及胎盘激素

指标对照组复发性流产组tPVDR1.08±0.490.24±0.174.860.00hCGR2.77±1.000.49±0.316.160.00ER1.36±0.970.48±0.382.390.04PR1.25±0.750.87±0.990.860.40

2.2蜕膜组织VDR及胎盘激素受体的表达

复发性流产组蜕膜组织VDR、hCGR及ER表达也明显低于对照组(t值分别为5.28、2.34、2.60，均P<0.05)，而PR两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.3绒毛和蜕膜组织VDR表达和胎盘激素受体表达的相关性检验

绒毛组织hCGR及ER的表达水平明显与VDR的表达相关(r=0.65，P=0.01；r=0.71，P=0.00)，而PR的表达与VDR无相关性。进一步回归分析显示hCGR及ER的表达与VDR的表达呈正相关(F=10.21，P=0.01；F=14.52，P=0.00)。蜕膜组织hCGR、ER及PR的表达水平均与VDR的表达无明显相关。

指标对照组复发流产组tPVDR0.96±0.320.33±0.125.280.00hCGR1.53±0.760.58±0.862.340.04ER1.85±1.070.78±0.492.600.02PR0.97±0.820.65±0.361.010.34

3讨论

3.1复发流产患者母胎界面VDR表达明显降低

本研究通过对母胎界面绒毛和蜕膜组织中VDR在早期RM患者和正常早孕妇女中基因转录水平的检测比较，结果显示孕早期RM患者母胎界面绒毛和蜕膜组织中VDR的基因表达水平均低于正常早孕对照组，差异有统计学意义。近期我们研究也显示RM患者母胎界面VDR的蛋白表达水平也明显低于正常早孕妇女[4]。表明VDR在人类胎盘绒毛和蜕膜组织中的表达对于维持母胎界面免疫平衡及妊娠的建立和维持具有重要的意义。以往动物实验结果显示，VDR基因敲除小鼠的生育能力和产仔数量降低[5]。在人类的研究也显示子宫内膜表现了VDR介导的复杂的细胞调控，在维生素D的作用下，着床期子宫内膜的容受性发生改变，其表达异常能够导致子宫内膜的病理改变，干扰着床。总之，母胎界面VDR表达降低可能与RM的发生相关。

3.2母胎界面VDR表达降低与RM发生的可能机制

虽然RM患者母胎界面VDR表达明显降低，但其降低导致自然流产的机制还不清楚。除有研究认为1,25(OH)2D3通过VDR影响细胞因子的代谢而调节妊娠期的免疫反应，1,25(OH)2D3可降低1型辅助性T细胞(T helper 1，Th1)细胞因子的分泌，增加Th2细胞因子的分泌，有利于Th1/Th2细胞因子的平衡，维持正常妊娠[6]。另外Barrear于2007年研究认为1,25(OH)2D3与胎盘激素的分泌有关，1,25(OH)2D3能调节雌激素、孕激素和绒毛膜促性腺激素的分泌，而这些激素的存在与妊娠的维持密切相关。本研究也发现母胎界面绒毛和蜕膜组织hCGR和ER表达在复发流产患者中降低，而且其在绒毛组织中的表达水平与VDR的表达水平明显呈正相关，说明其可能是VDR调节途径的靶基因。本课题组之前的研究也发现复发流产患者血清维生素D含量明显低于正常早孕妇女，而且复发流产患者维生素D低下的发生率明显高于正常早孕妇女[7]，因此通过改善维生素D水平，也许可以改善这些激素的分泌，从而改善妊娠结局，这还需要进一步前瞻性研究。

总之，本研究发现母胎界面VDR表达降低与复发性早期自然流产相关，而且VDR的表达水平影响了hCGR、ER的表达水平，改善维生素D的水平也许可以改善妊娠结局。

[1]Jeve Y B,Davies W.Evidence-based management of recurrent miscarriages[J].J Hum Reprod Sci,2014,7(3):159-169.

[2]Vojinovic J,Cimaz R.Vitamin D-update for the pediatric rheumatologists[J].Pediatr Rheumatol Online J, 2015,13:18.

[3]Singh A,Kamen D L.Potential benefits of vitamin D for patients with systemic lupus erythematosus[J].Dermatoendocrinol,2012,4(2):146-151.

[4]Yan X T,Wang L Q,Yan C F,etal.Decreased expression of the vitamin D receptor in women with recurrent pregnancy loss[J].Arch Biochem Biophys,2016,606:128-133.

[5]闫晓婷,于学文.维生素D对自然流产的免疫调节[J].中国妇幼健康研究,2014,25(6)：1100-1102.

[6]Wu M,Zhu Y,Zhao J,etal.Soluble costimulatory molecule sTim3 regulates the differentiation of Th1 and Th2 in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(6):8812-8819.

[7]Hou W,Yan X T,Bai C M,etal.Decreased serum vitamin D levels in early spontaneous pregnancy loss[J].Euro J Clin Nutri,2016,70(9):1004-1008.

[专业责任编辑：李春芳]

Relationship between vitamin D receptor expression on fetal-maternal interface and recurrent miscarriage and possible mechanism

YAN Chun-fang1, YAN Xiao-ting2, HUI Ling-yun2, WANG Li2, BAI E2, YU Xue-wen2

(1.ReproductiveCenter,Xi’anFourthHospital,ShaanxiXi’an710004,China;2.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To explore the relationship between vitamin D receptor (VDR) expression on fetal-maternal interface and recurrent miscarriage (RM) and placental hormone. Methods Villous and decidual tissue samples from patients with RM and those at normal early pregnancy were collected outpatient department of obstetrics and gynecology in the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University from July to September in 2014. VDR, human chorionic gonadotropin receptor (HCGR), estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) mRNA levels in two groups were detected by fluorescence real-time quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) and expression difference was compared. Results Women with RM had a significantly lower expression of VDR, HCGR and ER mRNA in villous tissues compared to normal pregnant women (tvalue was 4.86, 6.16 and 2.39, respectively,allP<0.05). HCGR and ER mRNA levels were positively correlated with VDR level in villous tissue (F=10.21,P=0.01;F=14.52,P=0.00). In decidual tissues, VDR, HCGR and ER mRNA in RM women were also lower than those in normal pregnant women (tvalue was 5.28, 2.34 and 2.60,respectively, allP<0.05). Conclusion VDR mRNA level on fetal-maternal interface is associated with early spontaneous abortion. HCGR and ER mRNA levels are positively correlated with VDR level in villous tissue. But further study is needed to investigate the mechanism of VDR causing spontaneous abortion.

recurrent miscarriage (RM); vitamin D receptor (VDR); fetal-maternal interface; human chorionic gonadotropin receptor (HCGR); estrogen receptor (ER)

2017-02-13

国家自然科学基金资助项目(81270697)

闫春芳(1964-)，女，主任医师，硕士研究生，主要从事生殖医学的研究。

于学文，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.00.010

R714

A

1673-5293(2017)05-0519-03