低氧训练状态下大鼠心肌组织细胞凋亡与血管新生的表达

邹志兵

(广西民族大学 相思湖学院，广西 南宁 530008)

● 运动人体科学

低氧训练状态下大鼠心肌组织细胞凋亡与血管新生的表达

邹志兵

(广西民族大学 相思湖学院，广西 南宁 530008)

目的：研究低氧训练状态下心肌组织细胞凋亡和血管新生的情况。方法：将60只健康雄性SD大鼠，随机分为6组,运动组采用负荷跑台训练8w，一周训练6d，运动量从最初的10 m/min、时间为15 min增加到第8周的速度为25 m/min、时间为50 min，每周逢双在海拔1500 m 的低氧环境下进行低氧训练，低氧浓度从最初的1500 m海拔高度增加到训练结束的3600 m海拔高度。结束训练后，采用戊巴比妥钠麻醉后取材。采用HE染色、TUNEL法进行细胞凋亡检测，Bcl-2、Bax和CD34的表达采用蛋白免疫组织化学方法进行检测，毛细血管的生成情况使用显微图象分析。结果：1)低氧对照组心肌组织细胞开始出现凋亡，血管生成没有；2)运动组心肌组织细胞有凋亡发生，血管生成也开始出现；3)低氧训练组与其它组别在凋亡方面没有显著性差异(p≥0.05)，但在血管新生方面表现出很大的差异性(p≤0.05)。以上情况提示低氧复合运动不会加重心肌组织细胞凋亡，但会促进血管新生。

低氧训练；细胞凋亡；血管新生

细胞凋亡是细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其它细胞吞噬的过程。在心脏的生理和病理发展过程中心肌细胞凋亡有很重要的作用。心肌细胞凋亡的因素影响有很多，如钙超载、自由基、DNA损伤、缺氧缺血、运动等。

血管新生是心肌组织的一种机体保护反映，心肌缺血状态得到改善，心肌组织能源物质和氧气的交换得以扩大，心脏的工作能力得到增强。血管新生的影响因素有很多，如肿瘤、低氧、缺血、运动等，这些过程都能诱发新的血管生成。

低氧训练既受运动负荷缺氧的影响、又受环境缺氧的刺激，其对心肌细胞凋亡和血管新生的情况如何，目前尚无文献报道。鉴于此，通过本实验观察低氧训练状态下大鼠心肌组织细胞凋亡和血管新生的表达情况，探讨两者之间的关联和分子机制，为低氧训练适应机理提供实验依据和参考。

1 研究方法

1.1 研究对象、分组及处理方法

将60只体重大约为200 g的雄性健康SD大鼠随机分为六组：A为对照组、B为低氧组、C为运动组、D为低住高练组、E为高住低练组、F为高住高练低练组，每个组别均为10只(见表1)。

1.2 运动训练方案

使用动物跑台，进行递增负荷训练，持续8个星期，每星期训练6天。

1.3 低氧情况

低氧舱中氧含量的变化采用氧气监测仪实时监测，所有低氧组大鼠居住在低氧舱中，低氧浓度从第1周的1500 m海拔高度升至第8周的3600 m海拔高度，每周升高300 m。

表1 SD大鼠各组处理方法

表2 大鼠运动训练方案(速度×持续时间)

1.4 标本制作

实验结束后，取大鼠整心按房间隔、室间隔的路线切开，常规脱水、透明、进蜡、石蜡包埋。

1.5 实验方法和检测指标

1.5.1 HE染色

将大鼠心脏标本按照常规方法进行石腊包埋、切片。再按常规方法脱腊、染色、封片。

1.5.2 Bax、Bcl-2和CD34检测

采用试剂盒检测 Bax、Bcl-2和CD34蛋白表达情况。采用Simple PCI图像分析系统测定阳性产物的表达。

1.5.3 细胞调亡检测

采用原位TUNEL细胞凋亡试剂盒进行细胞凋亡检测。方法：标本切片常规脱腊至水，由专业人员严格按照试剂盒说明书操作。采用普通光学显微镜进行观察，阳性凋亡细胞的细胞核染色呈棕黄色或棕褐色，细胞核DNA碎片有部分溢出，阳性染色也存在部分胞浆；没有凋亡细胞的细胞核被苏木素染成蓝色，形态大小均匀，核相对较大。在光学显微镜(×400)随机观察每张切片的6个视野，大约500个细胞的数量。采用Simple PCI显微图像分析软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数来计算凋亡指数。

1.5.4 微血管密度的计数

按照Feldser[1]报告的方法进行结果判断，用血管数目的平均数来表示。先在低倍镜(×40)下扫描整个视野的区域，选择高阳性物质表达密度区作为代表，然后在高倍镜(×200)下计数被抗CD34抗体染成棕色的血管数目，把单个存在的阳性表达物视为一个微血管。

1.5.5 微血管灰度水平和表达面积的测试

免疫组化阳性产物的灰度和面积采用Simple PCI图象分析系统进行分析。具体操作：每张切片在10×40倍镜下选取不相重叠的3个代表性视野，测量阳性产物的面积和灰度值以及所选区域的平均灰度值。

1.6 统计学分析

所得数据用SPSS17.0统计软件处理。数据采用平均数±标准差表示，采用方差分析来确定各组间的显著性差异水平。显著性水平标准为α=0.05，p≤0.05具有显著性差异，p≤0.01具有非常显著性差异。

2 结果

2.1 大鼠心肌组织细胞的HE染色结果

常氧组大鼠心肌细胞结构完整，没有出现异常改变(如图1A)。低氧组和常氧运动组大鼠心肌细胞结构开始有变化，大鼠核染色质固缩，集聚于核膜周边，细胞体变小(如图1B)。低氧运动组心肌细胞未见明显肿胀，间隙也不是很大，没有出现与邻近细胞脱离的现象，凋亡特征与低氧组和运动组相比较，不是很明显(如图1中C)。

图1 大鼠心肌组织细胞HE染色结果(×40)

2.2 大鼠心肌组织细胞TUNEL结果

如表3可知，所有实验组大鼠心肌组织检测结果之间无显著性差异。低氧对照组、运动组和低氧运动组大鼠心肌组织细胞凋亡检测结果显著高于对照组(p<0.01)，其余各组之间比较无显著性差异。

表3 各组大鼠心肌组织细胞凋亡指数(PI)检测结果

2.3 大鼠心肌组织Bax、Bcl-2和CD34免疫组织化学染色结果

2.3.1 Bax

由表3、4可知，所有试验组大鼠与常氧对照组比较，心肌组织Bax的检测结果有显著性差异，其余各组之间相互比较无显著性差异。

2.3.2 Bcl-2

由表3、4可知，所有试验组大鼠与常氧对照组比较，心肌组织Bcl-2的检测结果有显著性差异，其余各组之间相互比较无显著性差异。

表4 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2蛋白表达结果

2.3.3 大鼠心肌组织CD34免疫组织化学结果

CD34免疫组织化学染色阳性表达呈棕黄色,着色比较鲜明，紫色显示的是细胞核。微血管的形态各种各样，有的新生血管开始成形，有管腔出现(图2A)，有的只是不清晰的条状或点状(图2B)。不同的低氧训练模式，血管的数量也有不同的表达。低氧组与常氧组变化不是很明显(图2A)，运动组与常氧组、低氧组比较开始出现差异(图2B)。三种低氧训练组与前面几组相比较，开始有大量血管新生生成，表现很明显(图2C)。

2.3.4 大鼠心肌组织微血管显微图象观察分析结果

图2 大鼠心肌组织CD34免疫组织化学染色(×40)

表5 心肌组织血管新生免疫组织化学图像分析结果

3 分析讨论

3.1 低氧对心肌组织细胞凋亡和血管新生的表达

目前关于低氧与心肌细胞凋亡的研究，国内外已较为广泛。细胞低氧的程度、时间决定了细胞是否走向凋亡或适应[2]。许多研究显示,冠状动脉梗阻2 h 即可引起大鼠心肌细胞凋亡；缺血45 min 后再灌注l h 可加剧细胞凋亡，提示单纯缺血和缺血后再灌注均可诱发细胞凋亡[3]。Tanaka等研究培养的新生鼠心肌细胞，发现细胞凋亡在低氧12 h 即可出现，并随低氧时间延长逐渐加重。本实验研究结果说明随着低氧时间的延长，心肌组织细胞凋亡开始增加，与前人研究结果基本一致。

关于低氧与血管新生，说法不一。邹志兵[4]等在低氧训练促进心肌组织微血管新生免疫组化研究表明，只是低氧处理大鼠心肌组织微血管密度不会增加，低氧中见到的毛细血管密度的增加不是由于血管新生，而是因为肌纤维横断面减少所致。国内有学者观察大鼠在模拟5000 m 高原短期时间内不见有血管新生，但是随着时间的延长，毛细血管开始大量出现。本研究发现，单纯低氧组鲜见有毛细血管新生，但是有血管样结构，不具有功能性的血管。产生这些现象的原因可能与研究对象、低氧模式、低氧程度及低氧时的其它影响因素有关。

3.2 运动对心肌组织细胞凋亡和血管新生的表达

在运动过程中，心脏对一般的负荷缺氧会有适应，不会造成损害，这与心脏本身自身的应激有关，但这种适应是有条件和限度的，在运动过量或者是超负荷状态下，尤其是力竭状态下，心肌细胞的防御能力有限，会造成细胞凋亡。袁海平等[5]报道，运动后心肌细胞凋亡随着运动强度的加大，凋亡率也开始升高，SOD活性显著降低，而MDA含量显著升高。提示：运动可诱导心肌细胞凋亡，而运动后心肌细胞抗氧化能力下降，可能是凋亡发生的机制之一。常芸、郭勇力[6,7]等研究发现，中等强度运动组心肌细胞凋亡数与对照组相比，无显著性差异。且凋亡调控基因bcl-2mRNA表达明显增加，抑制心肌细胞凋亡。多数专家研究表明，大强度、过度训练和力竭运动均引起心肌细胞凋亡，对心肌造成严重损伤；而中小强度的耐力训练则可减少心肌细胞凋亡，对心肌有保护作用。本实验研究发现，心肌细胞与对照组相比较，凋亡较明显，说明运动强度还是比较大的。

Tagarakis等[8]研究认为,运动可使心肌毛细血管密度显著增加。邹志兵等[9]研究认为，心肌对运动的刺激较易发生血管生成。大量文献也表明,适宜的运动可以导致心肌组织中毛细血管数量增多。张小俊等[10]用HE染色用墨汁灌注的方法得出运动可以使老年大鼠毛细血管增生。分析其可能原因是有一部分毛细血管通过“动脉化”途径转变成动脉,从而无法观察到血管新生的现象。本研究发现运动训练组心肌组织血管生成开始增加，较不运动组和低氧组有显著性差异。

3.3 低氧运动对细胞凋亡和血管新生的表达

低氧可以诱导心肌细胞凋亡，训练亦可诱导心肌细胞凋亡，是否低氧训练将诱导更为严重的心肌细胞凋亡呢？这需要通过一系列实验来说明。林喜秀等[11]研究认为，低氧训练能使心肌细胞凋亡加剧。但本次实验结果认为，与对照组相比，细胞凋亡具有显著性差异，但低氧结合运动，并没有使细胞凋亡有明显的变化，低氧训练抑制了心肌组织细胞凋亡，这可能与不同的运动强度、不同的低氧浓度、以及常氧低氧不同的组合有关。

郑澜[12]等在低氧训练促进心肌组织微血管体视学研究中表明，低氧结合运动，可以产生丰富的毛细血管，但单纯的运动或者是低氧，这种现象不会发生。曾凡星[13]等研究经过4周的每天12 h 的海拔4000 m 慢性间歇低氧训练的大鼠，毛细血管开始增多，产生心脏的适应性变化。毛杉杉等观察到急性低氧力竭运动可引起心肌毛细血管新生，但属于暂时性现象。邹志兵[14]等发现每天在海拔3600 m慢性间歇低氧训练心肌组织的微血管生成明显。本研究结果也发现，低氧训练发现有大量的毛细血管生成，与以上各位专家研究的实验结果相一致。

4 结论

4.1 低氧能引起心肌细胞凋亡，但是不能促进血管新生。

4.2 运动能引起心肌细胞凋亡，凋亡的程度与运动强度、运动时间高度相关；运动能使心肌组织毛细血管数量增加。

4.3 低氧复合运动，不会加重心肌组织的细胞凋亡，但能显著增加毛细血管密度。

[1] Feldser D,Agani F,Lyer N, et al. Reciprocal positive regulation hypoxia inducible factor 1 a and insulin-like growth 2.[J].Cancer Res, 2004, 3915—3918.

[2] 林喜秀，周桔，罗志强，等.低氧训练与低氧大鼠心肌细胞凋亡及凋亡因子的表达[J].中国组织工程研究，2013,11:1951—1958.

[3] 邢维新.运动训练与心肌细胞凋亡研究的新进展[J].绵阳师范学院学报,2011,30(2):127—130.

[4] 邹志兵，郑澜.低氧训练促进大鼠新肌组织血管生成免疫组化研究[J].山东体育学院学院，2011,25(9):59—62.

[5] 袁海平,刘学.大鼠不同强度运动对心肌细胞凋亡及其抗氧化能力的影响[J].体育科学,2002,22(1):107—109.

[6] 常芸,袁箭峰,祁永梅,等.运动心脏重塑与微损伤发生中的细胞凋亡现象[J].中国运动医学杂志,2003,22(4):344—349.

[7] 郭勇力,刘霞,张文峰,等.不同强度运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中国临床康复,2004,8(9):1732—1733.

[8] Tagarakis C, Bloch W, Hartmang N,et al. Test osterone -propionate Impairs the Response of the Cardia Capillary Bed to Exercise[J].Med Sci Sports Exe,2003,32(5):946—953.

[9] 邹志兵.低氧训练时心肌组织细胞低氧诱导因子1α与凋亡相关蛋白的表达[J].中国组织工程研究，2015,12(10)：8305—8310.

[10] 张小俊,李付强,等.缺氧条件下心肌组织的形态学改变及缺氧诱导因子-1在心脏内的表达[J].中国老年学杂志，2013,10(23)：4231—4237.

[11] 林喜秀，瞿树林，等.低氧训练与低氧大鼠心肌细胞凋亡及凋亡因子的表达[J].中国组织工程研究，2013,03(12):1951—1958.

[12] 郑澜,陆爱云,周志宏.低氧训练促进大鼠新肌组织血管生成的体视学研究[J].体育科学，2005,25(9):59—62.

[13] 叶鸣,曾凡星.高住低训在运动实践中的应用[J].首都体育学院学报,2006,6(4):52—57.

[14] 邹志兵,郑澜.低氧训练对大鼠心肌组织微血管生成的影响[J].西安体育学院学报，2010,3(2)：194—197.

Expression of Hypoxic Training to Myocardial Apoptosis and Angiogenesis in Rats

ZOU Zhi-bing

(Xiangsi Lake College, Guangxi University Nationnalities , Nanning 530008，China)

Objective: To study the effects of Hypoxic Training to Myocardial Apoptosis and Angiogenesis in Rats. Methods: 60 male SD rats were randomly divided into six groups. 8 weeks progressive treadmill exercise program were designed with intensity starts from 10m/min for 15min at the first week to 26m/min for 50min in the last week and hypoxia degree from 1500m at the first week to 3600m in the last week. The protein expression of CD34, Bcl-2, Bax in the cardiomyocytes were analysis with HE staining, TUNEL, and immunity histochemistry. Microscopic image analysis capillary density, optical density level, express area. Results: 1) when simple hypoxic myocardial tissue apoptosis is exsited, but angiogenesis is not happened. 2) the move group reduced myocardial tissue Bcl-2 expression, Bax expression change is not obvious, the Bcl-2/Bax ratio decreased, promote apoptosis, expression of CD34 positive things began to emerge. 3) apoptosis in hypoxic exercise group compared with the low oxygen groups, sports group difference is not very big, but show great differences in terms of angiogenesis. Prompt low oxygen compound movement doesn't increase the apoptosis of myocardial cells, but will promote new blood vessels.

hypoxic training; apoptosis; angiogenesis

广西教育厅科研项目“低氧训练对大鼠心肌组织细胞凋亡和血管新生的研究”(KY2015YB499)

2016-08-17

邹志兵(1978—)，男，广西南宁人，副教授。研究方向：低氧训练的生理机制。

G804.7

A

1671-1300(2017)01-0098-06