温度对短尾根腐线虫繁殖力的影响及其胚胎发育过程

廖琳琳, 肖 顺, 刘国坤, 张绍升

(福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

温度对短尾根腐线虫繁殖力的影响及其胚胎发育过程

廖琳琳, 肖 顺, 刘国坤, 张绍升

(福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

在福建省花生种植区发现短尾根腐线虫的侵害.采用胡萝卜愈伤组织培养线虫，观察温度对线虫繁殖力的影响以及线虫在最适温度下的胚胎发育过程.研究表明，短尾根腐线虫繁殖的适宜温度为25～30 ℃，最适温度为30 ℃.30 ℃下短尾根腐线虫从产卵至2龄幼虫孵化需要8～9 d.

温度; 短尾根腐线虫; 繁殖力; 胚胎发育

近年来，福建省发现由咖啡根腐线虫(Pratylenchuscoffeae)和短尾根腐线虫(P.brachyurus)侵染引起的花生根腐线虫病[1-2].花生受根腐线虫侵染后，地上部植株发育不良，萎蔫变黄，地下部根系和荚果质量减小，果荚上形成黑色斑，严重时果荚腐烂，造成花生产量和品质下降.

短尾根腐线虫是福建省花生上的优势种群，分布于福建省多个花生产区.该线虫能侵染花生根、果针、荚果及种皮，接种实验证明其对花生有极强的致病性[2].我国学者对该线虫的研究主要集中在病原鉴定和致病性测定方面[2-5]，有关其胚胎发育及温度对其繁殖的影响情况等生物学特性方面的研究较少.因此，本文研究温度对短尾根腐线虫繁殖力的影响及其胚胎发育过程，以期为该病害的预测和防控提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试线虫样本

线虫标本采自福建省厦门市翔安区的花生荚果，经纯化培养和鉴定，确认为短尾根腐线虫.线虫样本保存于福建农林大学植物线虫学研究室.

1.2 温度对线虫繁殖力影响的测定

1.2.1 线虫培养 采用胡萝卜愈伤组织培养法[6].将经0.2%氯霉素表面消毒30 min后的30条线虫(幼虫∶雌虫=4∶1)接入灭菌培养皿内的单片胡萝卜愈伤组织中，培养皿盖用保鲜膜封固.用记号笔标明接种时间和温度处理，置于15、20、25、30和35 ℃培养箱中黑暗培养60 d，每个培养温度重复5皿.

1.2.2 观察计数 培养结束后，取出胡萝卜愈伤组织片,用解剖刀将其切成碎片，并倒入小烧杯中，加清水至没过碎片，用玻棒搅拌1 min后浸泡24 h.用1号线虫筛(孔径2 000 μm)过滤并将滤液倒入培养皿，在解剖镜下计数卵、幼虫和成虫数，统计不同温度下培养的线虫数量.

1.2.3 数据处理 繁殖率/%=(最终虫量-初始虫量)×100/初始虫量，采用DPS软件对数据进行方差分析，并用Duncan′s新复极差法进行多重比较.

1.3 线虫胚胎发育过程的观察

取出一片繁殖短尾根腐线虫的胡萝卜愈伤组织片，捣碎分离，将怀卵的雌虫挑入单凹玻片的水滴中产卵.产卵后，立即将单胞卵转移至另一凹玻片的水滴中，一个凹槽放置一个单胞卵，共9个重复，于30 ℃恒温培养箱中黑暗、保湿培养.每12 h取出一次，在光学显微镜下观察、记录胚胎发育过程.

2 结果与分析

2.1 温度对线虫繁殖力的影响

表1显示，在15～30 ℃，随着温度的升高，线虫卵量、幼虫量、成虫量、总量和繁殖率均不断升高.在30 ℃下，卵量、幼虫量、成虫量、总量和繁殖率均达到最高值，该温度下线虫的繁殖率与15、20、35 ℃下的繁殖率具有显著差异；15、20、35 ℃下的繁殖率没有显著差异.因此，短尾根腐线虫产卵和繁殖的适宜温度为25～30 ℃，最适温度为30 ℃.

表1 温度对短尾根腐线虫繁殖力的影响1)Table 1 Effect of temperature on reproduction capacity of P.brachyurus

1)数据为5个重复的平均值；同列数据后的小写字母表示在P=0.05显著性水平下的多重比较，字母相同者表示差异不显著，反之则差异显著.

2.2 最适温度下线虫的胚胎发育过程

短尾根腐线虫的卵为长椭圆形，表面光滑，平均大小为70.2(58.7～81.7) μm×29.4(24.5～37.1) μm.卵由外壳、卵黄膜和原生质等部分组成.

刚产的卵为单细胞，有球状颗粒布满卵腔(图1A).在30 ℃下，第1次卵裂发生在0.5 d内，方向与卵长轴垂直，中间出现一条界线，将单细胞隔开形成双细胞(图1B).之后，依细胞分裂快慢而异，形成3～5个细胞.1 d后形成4～10个细胞，1.5 d形成8～18个细胞(图1C).2 d后分裂加快，逐渐发育形成20个以上的多细胞，称之为桑葚期卵.3 d后，一部分发育较快的卵已进入囊胚期，其特点是有大、小细胞分化，小细胞群紧贴于卵黄膜形成外胚层，中间大细胞形成内胚层(图1D).3.5 d后卵进入原肠期，逐渐形成深浅不同的2种颜色细胞(图1E).4.5 d后卵发育进入蝌蚪期至蠕虫期，蝌蚪期卵的一侧细胞颜色较深，将形成线虫的尾，另一侧细胞颜色较浅，将形成线虫的其他部位；蠕虫期的卵形成2折结构(图1F).5 d后部分卵进入4折结构的1龄幼虫阶段，尚未分化形成口针和中食道球(图1G).6.5 d后所有卵处于1龄幼虫阶段.7 d后部分幼虫完成第1次脱皮，进入各个器官分化完整的2龄幼虫阶段，该阶段线虫口针强壮，有明显的基部球和中食道球(图1H).8 d后部分2龄幼虫破卵孵出，于水中自由蠕动.9 d后，所有2龄幼虫均从卵中成功孵出.由此可见，从卵产出至2龄幼虫孵出所需的时间为8～9 d(表2).

3 讨论

本研究表明，短尾根腐线虫繁殖的适宜温度为25～30 ℃，最适温度为30 ℃.该结果与Fourie et al[7]的研究一致.短尾根腐线虫卵的发育过程经历单胞期至多次分裂的多胞期，再进入囊胚期、原肠期、蝌蚪期、蠕虫期和1龄幼虫期，最后进入2龄幼虫期后孵化.这种胚胎发育模式与索恩根腐线虫(P.thornei)[8]和斯克里布纳根腐线虫(P.scribneri)[9]的分裂模式一致.30 ℃下，从卵产出至2龄幼虫孵出所需的时间为8～9 d.

A：单胞；B：双胞；C：多胞；D：囊胚期；E：原肠期；F：蠕虫期；G：1龄幼虫；H：2龄幼虫.图1 短尾根腐线虫胚胎发育各个时期Fig.1 Different stages of embryonic development of P.brachyurus

表2 短尾根腐线虫的胚胎发育过程Table 2 Embryonic development of P.brachyurus

花生原产于热带，较高的温度条件有利于其生长发育.福建春花生从播种到收获的时间为3月上旬—7月中旬，秋花生为8月上旬—12月中旬.可见，花生生长期大部分处于较高的温度；而短尾根腐线虫又是一种喜高温线虫，在这种温度下线虫可以完成多个生活史，并对花生造成严重侵染和危害.该线虫现已在厦门、宁德等地发生危害，有关部门应予以高度重视，积极采取有效措施，以防止其大面积传播扩散.

[1] 廖琳琳,章淑玲,肖顺,等.寄生于花生的根腐线虫种类鉴定及致病性测定[J].福建农林大学学报(自然科学版),2015,44(3):240-244.

[2] 章淑玲,廖琳琳,刘国坤,等.花生短体线虫病的病原鉴定与诊断[J].热带作物学报,2015,36(2):365-370.

[3] 杨意伯,张绍升.番石榴根部短尾根腐线虫的鉴定[J].热带作物学报,2013,34(8):1557-1563.

[4] 章淑玲,王宏毅,金亮.寄生台湾春兰的短体线虫种类鉴定[J].热带作物学报,2013,34(12):2463-2466．

[5] 赵立荣,崔汝强,王金成,等.从尼日利亚进境的芋头中截获最短尾短体线虫[J].植物检疫,2011,25(4):35-38．

[6] 张绍升.植物线虫病害诊断与治理[M].福州:福建科学技术出版社,1999.

[7] FOURIE H, VENTER G A, MC DONALD A H. Optimum temperature and inoculation levels for in vitro production ofPratylenchusbrachyuruson carrot discs[J]. South African Journal of Plant and Soil, 2003,20(1):44-45.

[8] CASTILLO P, TRAPERO-CASAS J L, JIMÉNEZ-DAZ R M. The effect of temperature on hatching and penetration of chickpea roots byPratylenchusthornei[J]. Plant Pathology, 1996,45：310-315.

[9] ROMAN J, HIRSCHMANN H. Morphology and morphometrics of six species ofPratylenchus[J]. Journal of Nematology, 1969,1(4):363-368.

(责任编辑:杨郁霞)

Influence of temperature on reproductive capacity ofPratylenchusbrachyurusand its embryonic development

LIAO Linlin, XIAO Shun, LIU Guokun, ZHANG Shaosheng

(College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Pratylenchusbrachyuruswas detected from the peanut production areas of Fujian Province. The nematodes were cultured on carrot callus tissues, and the effect of temperature on reproductive capacity and morphological changes during embryonic development under optimum temperature were recorded. The results showed that the suitable temperature range for nematode production was 25-30 ℃ with the optimal temperature being 30 ℃. And it took 8-9 d for eggs to reach 2 instar larvae when hatched at 30 ℃.

temperature;Pratylenchusbrachyurus; reproductive capacity; embryonic development

2016-10-12

2016-11-07

国家自然科学基金(31201495).

廖琳琳(1989-)，女，助理实验师.研究方向：植物病理学.Email:liaolinlin100@126.com.通讯作者张绍升(1951-)，男，教授.研究方向：植物病理学和植物线虫学.Email:shaoshengzhang@126.com.

S432.4

A

1671-5470(2017)03-0247-03

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.002