利用分子标记辅助选择技术改良水稻恢复系N175的稻瘟病抗性

毛大梅，官华忠, 王志赋，陈志伟，潘 明，潘润森，周元昌，吴为人

(1.福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室；2.福建农林大学福建省作物设计育种重点实验室，福建，福州，350002；3.福建省农业科学院水稻研究所，福建，福州，350003)

利用分子标记辅助选择技术改良水稻恢复系N175的稻瘟病抗性

毛大梅1,2，官华忠1,2, 王志赋3，陈志伟1,2，潘 明1,2，潘润森1,2，周元昌1,2，吴为人1,2

(1.福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室；2.福建农林大学福建省作物设计育种重点实验室，福建，福州，350002；3.福建省农业科学院水稻研究所，福建，福州，350003)

以水稻恢复系N175为轮回亲本，与携有稻瘟病抗病基因Pi-1/Pi-9/Pi-kh的恢复系金恢1059进行杂交和3次回交，并利用SSR标记对抗病基因进行跟踪选择，最终得到了16个N175的抗病近等基因系，其遗传背景恢复比例均达96.50%以上。室内接菌和田间自然诱发鉴定表明，N175的抗病近等基因系及其与不育系龙特浦A组配的杂交种的抗性表现均为抗(R)，与供体亲本金恢1059相当，而N175和杂种特优175(龙特浦A/N175)分别表现为感(S)和高感(HS)。多数近等基因系与龙特浦A配制的杂种的主要农艺性状与特优175相近，其中8个杂种单株粒重高于特优175，2个杂种比特优175增产10%以上，说明这些新育成的抗病杂种基本上保留了特优175的优良特点，个别杂种的综合性状还明显优于特优175。

水稻; N175; 稻瘟病抗性; 分子标记辅助育种

水稻的稳定增长对保障国家食物安全起基础作用[1].在某种意义上可以认为水稻单产的高低是维系我国社会稳定的关键因素[2].水稻生产与环境关系密切，在水稻生产上常常受到白叶枯病、纹枯病和稻瘟病的危害，造成减产和巨大的经济损失，严重危及世界和中国的粮食安全.稻瘟病(pyricularia grisea)是全球水稻生产中危害面积最广、危害性最大的真菌性病害之一.据何峰等报道，从2004—2013年我国水稻稻瘟病年平均危害面积大约5×106hm2，每年造成的水稻产量损失达到1.5×109kg[4].水稻生产实践证明，防治稻瘟病最安全最有效的方法是选育和推广优良的抗病品种.分子标记辅助育种(molecular marker-assisted selection, MAS)是通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行选择性育种，它的优点是可以缩短育种年限，在分离世代中就可以确定基因型，提高育种效率，这样就减少了选择的盲目性，并能实现多个抗性基因的累加，培育出持久广谱的抗性品种[7].育种实践证明，通过标记辅助选择将抗稻瘟病基因导入杂交稻亲本是改良杂交稻抗性的重要途径.对水稻稻瘟病抗性基因研究显示，Pi-9基因来源于四倍体小粒野生稻，是目前已克隆稻瘟病抗性基因中抗谱最广的抗源[8].来源于西非粳稻品种LAC23的Pi-1是显性广谱高抗稻瘟病基因[9].刘文德等[10]用30个水稻抗稻瘟病近等基因系或单基因系品种对福建省水稻产区采集的稻瘟菌108个代表菌系进行抗病性测定，其中，水稻抗稻瘟病基因Pi-kh、Pi-1和Pi-9(t)抗性较强, 抗性频率高，是较好的抗源.

水稻三系恢复系N175系福建省南平市农业科学研究所选育的优良恢复系，采用N175与福建省漳州市农业科学研究所育成的三系不育系龙特浦A配制的杂交水稻组合特优175株叶态好、杂种优势强、产量高.该品种于1998—1999年参加福建省区试，两年平均产量6 807 kg·hm-2，比对照汕优63增产11.14%.2000年通过福建省品种审定[11].特优175曾作为福建省主推组合在福建、广西等地大面积推广应用，为当地水稻增产、农民增收起到很大的作用.但是，由于特优175推广应用时间已久，稻瘟病抗性逐渐减弱，已成为易感稻瘟病组合，生产应用风险加大.为了提高N175的抗性，加大特优175的推广应用，本研究将通过N175与金恢1059(携有Pi-1/Pi-9/Pi-kh)杂交和连续3次回交，利用分子标记辅助选择技术和回交育种方法相结合将稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-9、Pi-Kh导入到恢复系N175中,以期提高以N175为亲本的杂交稻组合对稻瘟病的抗性.

1 材料与方法

1.1 供试材料

抗性供体亲本：金恢1059，携有分别来源于C101LAC(Pi-1)、75-1-217(Pi-9)和IRBLkh-K3(Pi-Kh)的3个抗病基因，系本课题组通过分子辅助选择技术育成的优质恢复系.

受体亲本：N175，系福建省南平市农业科学研究所选育的优良恢复系，用N175与福建省漳州市农业科学研究所育成的三系不育系龙特浦A(简称特A)配制的杂交水稻组合特优175株叶态好、杂种优势强、产量高.

1.2 方法与步骤

1.2.1 技术路线 用供体亲本金恢1059携有Pi-1/Pi-9/Pi-Kh与受体亲本N175进行杂交，在F1代进行回交后，在回交一代(BC1F1)群体中，利用分子标记(MRG4766、RM206和FP1+FP2+RP)和株叶形态筛选出含杂合抗病基因型单株，用这些单株再与受体亲本进行第2次回交，在回交二代(BC2F1)群体中，利用分子标记和株叶形态筛选出含杂合抗病基因型单株，再用筛选出来的单株与受体亲本进行第3次回交，在回交三代(BC3F1)群体中，利用分子标记和株叶形态筛选出含杂合抗病基因型单株，收其自交种子BC3F2，利用上述方法选择出抗病基因均为纯合且像N175的单株，自交收种，得到近等基因系.对其自交后代进行稻瘟病抗性鉴定、背景选择和杂种优势鉴定.

1.2.2 分子鉴定 (1)目标抗性基因分析:利用与Pi-1、Pi-9和Pi-kh基因紧密连锁的分子标记对目标基因进行跟踪(表1)，并在整个基因组均匀挑选48对SSR引物对其进行遗传背景恢复检测.DNA提取和PCR方法参照段远霖等[12]方法.

表1 与三个抗病基因紧密连锁的分子标记引物序列Table 1 Primer sequences of markers related to blast-resistant genes

(2)遗传背景分析:从已公布的水稻SSR标记中选取均匀分布于水稻12条染色体上的多态性标记,利用这些标记对抗病近等基因系进行遗传背景检测，并对各近等基因系通过DPS软件进行聚类分析.

1.2.3 稻瘟病抗性鉴定 (1)室内稻瘟病抗性鉴定:在福建省农科院植保所，采用混合菌株以N175为感病对照，对N175抗病近等基因系及其与龙特浦A组配的杂交种，进行稻瘟病抗性苗瘟鉴定.对三叶一心期的水稻幼苗进行喷雾接种，一般情况下每秧盘喷施50 mL孢子悬浮液(菌液浓度为100倍显微镜下每视野含10～30个孢子).接种病菌1周后，目测观察各品种叶片上病斑反应型，若在同一株叶片上出现不同的病斑反应型，以最高反应型为准.病斑分为6级(0～3级为抗病，4～6级为感病).

(2)苗期自然条件诱发鉴定:福建省上杭县茶地乡位于汀江支流黄潭河水脉的山谷丘陵地，海拔390 m，阳光充足、土壤沙质、肥力中等，相对湿度90%，雾大露重，是福建省稻瘟病重灾区.将育成的抗病近等基因系以及其与龙特浦A组配的杂交F1、抗病和感病对照品种，按株系种植于福建省上杭县茶地乡进行田间苗瘟抗性鉴定.

1.2.4 杂种优势鉴定 利用抗病近等基因系与特A配制杂种一代，通过观察N175抗病近等基因系与龙特浦A的杂种后代的主要农艺性状(包括生育期、株高、每穗粒数、有效穗数、着粒密度、穗长、结实率、千粒重、谷粒长宽比及单株粒重等)，确定这些株系是否保持N175的基本特性.

2 结果与分析

2.1 目标抗病基因分析

利用与3个抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-9、Pi-Kh紧密连锁分子标记MRG4766、FP1+FP2+RP以及RM206检测N175的抗病近等基因系，结果表明，3个分子标记均能将各抗病近等基因系与受体亲本N175区分开来，且与供体亲本金恢1059的标记基因型一致(图1)，说明抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-9、Pi-Kh已成功导入到这16个抗病近等基因系中.

A、B、C 分别为与目标基因紧密连锁的分子标记RM206(与Pi-Kh紧密连锁)、FP1+FP2+RP(与Pi-9紧密连锁)和 MRG4766(与Pi-1紧密连锁)对目标基因的检测结果，每个图片从左到右依次为抗病近等基因系(1～16)，金恢1059(17)和N175(18).图1 N175抗病近等基因系前景选择结果Fig.1 Foreground selection of near-isogenic lines of N175

2.2 遗传背景分析

选取均匀分布于水稻12条染色体上的48个SSR标记对抗病近等基因系进行遗传背景检测，并对各近等基因系进行聚类分析(图2).结果表明，各抗病近等基因系与N175被聚为1个群，相似系数为96.50%～100.00%，其中，Line4和Line5与N175最相似(相似系数为100.00%)；而与供体亲本金恢1059(简称R1059)具有明显的差异.说明所选育的16个品系遗传背景基本恢复为N175的遗传背景，且Line4和Line5背景恢复程度最高.

2.3 抗病性鉴定

为了明确N175抗病近等基因系对稻瘟病的抗性，分别做了室内稻瘟病抗性鉴定和苗期自然条件诱发鉴定.在室内，对N175抗病近等基因系及其与龙特浦A组配的杂交种进行抗性和抗谱鉴定，以金恢1059为抗病对照，N175和特优175为感病对照.结果表明，各抗病近等基因系及其与特A组配的杂交种对稻瘟病的抗性表现均为抗病(R)，与抗病对照金恢1059的抗性结果一致，但各株系的病情指数有一定差异，其中与特A组配的杂交种中的两个株系Line7和Line8病情指数分别为1.11%、3.17%，有发病情况，但仍表现为抗病；而感病对照N175表现为感病(S)，病情指数为60.00%，特优175表现为高感(HS)，病情指数为60.73%(表2).

图2 近等基因系的SSR分析聚类Fig.2 Clustering analysis of near-isogenic lines of N175 using SSR

表2 室内与田间稻瘟病抗性鉴定结果1)Table 2 Blast resistance test in the greenhouse and field

1)R表示抗病；S表示感病；HS表示高感.

将16个抗病近等基因系及其与龙特浦A组配的杂交种和两个对照于稻瘟病高发的上杭茶地乡进行田间抗性鉴定，其结果与室内鉴定相似，即各抗病近等基因系及其与龙特浦A组配的杂交种的田间抗性均高于感病对照N175(为感病)，而与抗病对照金恢1059的抗性相当，均表现为抗病(R).

室内稻瘟病抗性鉴定和苗期自然条件诱发鉴定结果，说明利用分子标记辅助选择技术对N175的稻瘟病抗性改良是成功的，所选育的N175抗病近等基因系表现出较强的稻瘟病抗性水平.

2.4 杂种优势鉴定

为了进一步明确N175抗病近等基因系是否保留N175的主要优点，将N175和N175的其中12个抗病近等基因系与特A配置杂种F1，进行主要农艺性状比较，这些近等基因系与特A配制的杂种的农艺性状没有明显差异(表3).在育种家最关心的产量性状方面，8个近等基因系与特A配制的杂交种比对照特优175增产，增产幅度0.86%～11.27%；但也有4个株系与特A配制的杂交种比对照特优175减产，减产幅度1.72%～18.41%.在生育期方面，所有组合的生育期都与对照相当，变化幅度-1～2.74天，因此，新育成的抗病近等基因系配制的组合在适合推广区域方面与原有的品种差异不显著.

表3 龙特浦A与各抗病近等基因所配杂种考种结果Table 3 Main agronomic traits of hybrids derived from near-isogenic lines of N175 and Longtepu A

3 小结与讨论

分子标记辅助选择作为现代育种技术，对传统育种起到较大促进作用，既高效又经济，且不受环境条件影响.目前已有较多通过MAS成功地把水稻抗病基因导入杂交稻亲本的实例.如金素娟等将Pi-1抗性基因导入到两系不育系GD-8s中[16].陈红旗等[17]将含有Pi-1等3个抗性基因导入到保持系金23B中，得到了含有3个抗性基因的株系，其抗稻瘟病抗性大大高于只有单个抗性基因的供体材料.柳武革等[18]以两系核不育系GD-7S为受体，与含有Pi-2和Pi-1的BL122为供体亲本杂交、利用分子标记选择技术得到多个带2个抗性基因的纯合抗病株系，最终获得2个的抗性达到高抗的株系，而且农艺性状与受体亲本无显著差异.

本研究利用课题组前期育成的携有3个稻瘟病抗性基因的优质恢复系金恢1059为抗源，通过1次杂交，3次回交，1次自交，结合分子标记辅助回交技术把来源于不同抗源的3个稻瘟病抗性基因同时导入强恢复系N175中，在选择过程中，首先通过株叶形态进行选择，对初步选中的单株进行稻瘟病抗性基因的标记基因型检测，选中的单株继续进行回交，从而在3年内获得携有3个稻瘟病抗性基因(Pi-1、Pi-9、Pi-Kh)且保持N175优良特性的抗病近等基因系，通过这些新的近等基因系与特A配制的杂种的杂种优势比较，结果证实本研究新育成的部分抗病近等基因系配制种杂种具很强的杂种优势且稻瘟病抗性得到提高.值得一提的是，利用“NY/T 1433-2007水稻品种鉴定DNA指纹方法”中规定的24对SSR引物对本研究育成的改良系Line5和N175的DNA指纹进行分析，结果表明，Line5与N175是高度相似，即24对引物在Line5和N175间均没有多态性.在产量方面，该组合的单株重也比特优175增产5.10%.因此，近等基因系Line5有望直接替代原有感病的N175应用于生产.此外，本研究育成的近等基因系Line9和Line10与N175的DNA指纹差异较大，24引物中有2个引物扩增出多态性片段，且这2个株系配制的杂种优势比特优175强，其中Line9和Line10与特A配制的杂种产量明显比特优175高，比特优175增产分别达11.27%和10.81%.因此，这些特优组合可以作为新的组合参加区试和审定.同时，利用这些抗病近等基因与不同的不育系进行配组，有可能筛选出优质、抗病、高产的杂交稻组合.综上所述，本研究对N175的改良是非常成功的，应用前景广阔.

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(责任编辑:吴显达)

Improvement of rice blast resistance of restorer line N175 by marker-assisted selection

MAO Damei1,2, GUAN Huazhong1,2, WANG Zhifu3, CHEN Zhiwei1,2, PAN Ming1,2,PAN Runsen1,2, ZHOU Yuanchang1,2, WU Weiren1,2

(1. Key Laboratory for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Ministry of Education，Fujian Agriculture and Forestry University; 2. Fujian Provincial Key Laboratory of Crop Breeding by Design, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian, 350002, China; 3. Rice Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian, 350003, China)

With restorer lines Jinhui 1059 carrying rice blast resistant genesPi-Kh,Pi-1 andPi-9 as donor parent and N175 as recipient parent, a cross between the two parents was conducted, followed by three rounds of backcrossing. Marker-assisted selection was performed during the process, by which the three target resistant genes were successfully pyramided into N175, resulting in 16 near-isogenic lines (NILs), each with more than 96.50% similarity to N175 in genetic background. The results of blast resistance test in greenhouse and field indicated that the 16 NILs and their hybrids with male sterile line Longtepu A all exhibited a high resistance level equivalent to the donor parent Jinhui 1059, much higher than the recipient parent N175 and its hybrid with Longtepu A, Teyou 175, respectively. Most of the hybrids of the NILs with Longtepu A were very similar to Teyou 175 in main agronomic traits. Among the hybrids, 8 showed higher grain weight per plant than Teyou 175, and 2 showed over 10% increase in yield. The results suggest that the newly bred blast-resistant hybrids basically maintain the elite comprehensive agronomic traits of Teyou 175, with some obviously superior to Teyou 175.

rice; N175; resistant to rice blast; marked-assisted selection

2016-08-18

2016-12-29

福建省科技重大专项专题(2013NZ0002-2).

毛大梅(1975-)，女，实验师.研究方向：作物遗传育种.Email:fjmdm@126.com.

S511

A

1671-5470(2017)03-0241-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.001