一株双酚A降解菌的筛选、鉴定及其生长、降解条件

王 迪，马溪平，孟雪莲，董文灵，董 兴，徐成斌

（1. 辽宁大学 环境学院，辽宁 沈阳 110036；2. 辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036）

一株双酚A降解菌的筛选、鉴定及其生长、降解条件

王 迪1，马溪平1，孟雪莲2，董文灵1，董 兴1，徐成斌1

（1. 辽宁大学 环境学院，辽宁 沈阳 110036；2. 辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036）

从沈阳北部污水处理厂曝气池活性污泥中驯化、分离及筛选得到一株以双酚A为唯一碳源的高效降解菌株D-17，通过菌体形态、生理生化反应特性及16S rDNA基因测序分析对其进行了鉴定，并研究了该菌株的生长及双酚A降解条件。菌种鉴定结果表明，该菌为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）。实验结果表明：该菌株的生长及降解双酚A的最适条件为溶液pH 7.0，接种量10%，摇床转速150 r/min，降解温度30 ℃，降解时间5 d；当双酚A初始质量浓度为60 mg/ L时，双酚A降解率达52.62%；投加蛋白胨后，双酚A降解率提高至57.15%。

乙酸钙不动杆菌；双酚A；菌种鉴定；降解条件

双酚A遍及人们生活的诸多领域，是环氧树脂和聚碳酸酯等很多聚合型化工产品的原料［1-2］。近年来，在全球范围内，特别是发达地区的水环境中，都检测到了双酚A的存在［3-6］。在我国辽宁省等区域的地表水中也曾发现存在较高浓度的双酚A［7-8］。双酚A具有的高毒性及持久性会对人类健康及环境造成严重威胁，目前该物质已被美国环境保护署认定为内分泌干扰物（EDCs）［9-11］。

水环境中双酚A的去除方法有很多，但相比于物理方法和化学方法，生物降解双酚A的优势是低成本、高去除率和长降解持续周期，利用好氧微生物去除双酚A的效果更为显著［12-13］。目前，假单胞菌、新鞘氨醇杆菌、芽孢杆菌及少动鞘氨醇单胞菌等双酚A降解菌，均被人们分离得到［11，14-20］。2006年Kwon等［21］进行了乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）作为双酚A降解菌的相关研究，结果显示该菌株对双酚A的最大耐受浓度为1 140 μg/ mL，影响其降解效果的两个因素的最佳值为：降解温度30 ℃，降解pH 7.0。

本工作从沈阳北部污水处理厂驯化获得一株以双酚A为碳源的双酚A降解菌，进行了菌种鉴定，并对该菌株进行了生长及双酚A降解条件的研究，以期为乙酸钙不动杆菌作为双酚A高效降解菌的生物降解研究提供理论依据。

1 实验方法

1.1 实验材料

富集培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏4，NaCl 5，pH 7.0；无机盐培养基（g/L）：NaCl 1，MgSO40.2，NH4Cl 0.1，KH2PO41，Na2HPO4·12H2O 3.8，pH 7.0；分离培养基（g/ L）：蛋白胨10，NaCl 5，牛肉膏4，琼脂20%（w），pH 7.0。以上培养基皆添加双酚A溶液（经少量无水乙醇助溶），使双酚A 质量浓度为60 mg/L，在121 ℃的条件下灭菌处理30 min。

活性污泥：取自沈阳北部污水处理厂曝气池。

1.2 菌株的驯化、分离和筛选

在富集培养基中富集耐双酚A菌株后，再用含双酚A的无机盐培养基对菌株进行不断地驯化，每隔6 d按10 mg/L的梯度增加双酚A质量浓度至60 mg/L。经在分离培养基上多次平板划线后，从25个菌落中通过镜检及降解能力实验，最后获得一株以双酚A为碳源且降解能力相对较强的纯菌菌株D-17。

1.3 菌种鉴定

以革兰氏染色结果、菌落特征和生理生化特性为菌株的初步鉴定依据。委托哈尔滨博仕技术有限公司进行16S rDNA序列分析，应用CLUSTALX 2.0及MEGA 5.10软件构建NJ（Neighbor-joining）进化树。

1.4 生长及降解条件的优化

将处于对数生长期的菌株D-17接种于含60 mg/L双酚A的无机盐培养基中，以不同的溶液pH、接种量、降解温度、摇床转速、外加有机物为考察条件，振荡摇床培养5 d，测定菌株的生长情况及双酚A降解效果。

1.5 分析方法

双酚A质量浓度的测定：将待测菌液置于离心机中离心（12 000 r/min，1 min），采用美国Varian公司Cary 50型紫外分光光度计测定上清液在波长275 nm处的吸光度，以未接菌无机盐培养基为空白对照，计算双酚A质量浓度。

菌体浓度的测定：采用同上紫外分光光度计，测定待测菌液在 600 nm波长处的光密度值（OD600），以此表征菌体浓度。

2 结果与讨论

2.1 菌株D-17的鉴定

菌株D-17菌落呈边缘规则、淡黄色、不透明的圆形，表面凸起、湿润、光滑而有光泽，菌体无鞭毛，无芽孢，杆状，静止期呈圆形，大小为（0.7～1.3）μm×（0.3～2.1）μm；革兰氏染色呈阴性。菌株D-17的生理生化试验结果见表1。

表1 菌株D-17的生理生化试验结果

根据16S rDNA序列分析结果，鉴定该菌株为乙酸钙不动杆菌，在Genbank中登录号为AJ888983。菌株D-17的系统进化树见图1。

2.2 菌株D-17的生长曲线

在溶液pH为7.0、接种量为10%、降解温度为30 ℃、摇床转速为150 r/min的条件下，菌株D-17的生长曲线和双酚A降解率见图2。由图2可见：0～2 d时为菌株D-17的生长停滞期，菌体浓度和双酚A降解率都增长缓慢；2～4 d时为菌株D-17的对数增长期，大量繁殖的菌株细胞使双酚A的降解率迅猛增加；4～5 d时为菌株D-17的生长稳定期，生长曲线走势较为平稳，菌体浓度和双酚A降解率变化不大，5 d时双酚A降解率达到了最大值52.62%。因此，选定5 d为最佳降解时间。

图1 菌株D-17的系统进化树

2.3 菌株D-17生长与降解条件的确定

2.3.1 溶液pH对菌株D-17生长和降解性能的影响在接种量为10%、摇床转速为150 r/min、降解温度为30 ℃、降解时间为5 d的条件下，溶液pH对双酚A降解率和OD600的影响见图3。

图3 溶液pH对双酚A降解率和OD600的影响

由图3可见：过酸和过碱的环境皆会对双酚A的降解产生负面作用；溶液pH在6.0～8.0时，菌株D-17的生长情况和双酚A的降解情况均较佳，弱碱环境（pH=8.0）下略好于弱碱环境（pH=6.0）；溶液pH为7.0时，菌株的生长状态及双酚A降解状况最优。有报道称生物降解双酚A过程中能产生一种中间产物4-丙烯酸羟丁酯，营造出弱酸性的菌株生长环境［21-23］。因此，将7.0选为菌株D-17的最适溶液pH。

2.3.2 接种量对菌株D-17生长和降解性能的影响

在溶液pH为7.0、摇床转速为150 r/min、降解温度为30 ℃、降解时间为5 d的条件下，接种量对对双酚A降解率和OD600的影响见图4。由图4可见：接种量为1%～10%时，对菌株D-17生长及双酚A降解效果的影响非常明显，菌体浓度逐渐增大，双酚A降解率明显提高，说明贫营养环境会抑制好氧菌株细胞生长和降解率提高［24］；接种量为10%时，菌株D-17生长状态及双酚A降解效果都达到最佳；当接种量超过10%时，接种量变化对菌株D-17生长状况的影响不再明显，此时菌株D-17数量过多，造成生长所需双酚A的量严重不足。故将10%作为培养菌株D-17的最佳接种量。

图4 接种量对双酚A降解率和OD600的影响

2.3.3 摇床转速对菌株D-17生长和降解性能的影响

在溶液pH为7.0、接种量为10%、降解温度为30 ℃、降解时间为5 d的条件下，摇床转速对双酚A降解率和OD600的影响见图5。由图5可见：在摇床转速不足150 r/min时，菌株D-17的生长曲线及双酚A降解曲线随摇床转速的增加而呈上升趋势，这可能是由于菌株D-17是好氧菌，而摇床转速的加快增加了溶液的含氧量，进而促进菌株D-17的生长及双酚A的降解；当摇床转速过高（大于150 r/min）时，菌株D-17菌体浓度及双酚A降解率的增长开始变得迟缓。从能量和效率两方面进行思考，选择150 r/min为菌株D-17降解双酚A所用摇床转速的最适值。

图5 摇床转速对双酚A降解率和OD600的影响

2.3.4 降解温度对菌株D-17生长和降解性能的影响

在溶液pH为7.0、接种量为10%、摇床转速为150 r/min、降解时间为5 d的条件下，降解温度对双酚A降解率和OD600的影响见图6。

图6 降解温度对双酚A降解率和OD600的影响双酚A降解率：● 菌株D-17；■ 空白对照；

由图6可见：降解温度为30～35 ℃时，菌体浓度较高，双酚A降解率较高；降解温度低于30 ℃时，温度的逐步增高导致菌体浓度和双酚A降解率呈上升趋势；当降解温度超过35 ℃时，菌株D-17的生长与代谢受到抑制，双酚A降解率随降解温度的提高而逐渐变小。因此，将30 ℃设定为菌株D-17降解双酚A所需降解温度的最适值。

2.3.5 外加有机物种类对菌株D-17生长和降解性能的影响

在溶液pH为7.0、接种量为10%、摇床转速为150 r/min、降解温度为30 ℃、降解时间为5 d、外加有机物加入量为0.1%（w）的条件下，外加有机物种类对双酚A降解率和OD600的影响见图7。由图7可见：葡萄糖、乳糖和蔗糖均可不同程度地抑制双酚A的降解，尤其是葡萄糖使双酚A降解率由原来（无外加有机物）的52.18%降低到40.37%；而蛋白胨和尿素对双酚A的降解起到促进效应。相比双酚A，葡萄糖、乳糖和蔗糖的结构相对简单，菌株会优先利用更易于被降解的外加有机物；而蛋白胨和尿素皆为微生物的生长提供氮源，而且并不会与双酚A产生竞争性抑制，不造成有毒有害的影响；特别是蛋白胨的加入对菌株D-17的生长及双酚A降解的促进效果尤佳，可使双酚A降解率增加到57.15%。由此可见，对比其他4种外加有机物，蛋白胨是菌株D-17生长所需营养物质中最佳的一个。

图7 外加有机物种类对双酚A降解率和OD600的影响

3 结论

a）从沈阳北部污水处理厂曝气池活性污泥中驯化、分离及筛选得到一株以双酚A为碳源的高效菌株D-17，经鉴定为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）。

b）菌株D-17的生长和降解双酚A的最适条件为：溶液pH 7.0、接种量10%、摇床转速150 r/min、降解温度30 ℃、降解时间5 d。在最适条件下，双酚A（初始质量浓度60 mg/L）的降解率达到52.62%。投加0.1%（w）葡萄糖、乳糖和蔗糖可抑制菌株D-17降解双酚A，而当添加0.1%（w）蛋白胨和尿素时，菌株D-17的生长和双酚A的降解均得到了一定程度的促进，当蛋白胨加入量为0.1%（w）时，双酚A降解率可增加至57.15%。

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（编辑 叶晶菁）

Screening，identification of a bisphenol A-degrading strain and its growth and degradation conditions

Wang Di1，Ma Xiping1，Meng Xuelian2，Dong Wenling1，Dong Xing1，Xu Chengbin1
（1. School of Environmental Science，Liaoning University，Shenyang Liaoning 110036，China；2. School of Pharmacy，Liaoning University，Shenyang Liaoning 110036，China）

A high-effi ciency degradating strain D-17，which could use bisphenol A（BPA）as sole carbon source，was obtained by acclimation，isolation and screening from activated sludge in a aeration tank of Shenyang northern sewage treatment plant. The strain was identified by morphological，physiological and biochemical analysis and 16S rDNA gene sequence analysis，and its growth and degradation conditions were studied. The identifi cation results showed that D-17 was an Acinetobacter calcoaceticus strain. The optimum conditions for D-17growth and BPA degradation were as follows：solution pH 7.0，inoculation amount 10%，rotary speed 150 r/min，degradation temperature 30 ℃ and degradation time 5 d. When the initial mass concentration of BPA was 60 mg/L，the BPA degradation rate was 52.62%；With the addition of peptone，the BPA degradation rate was increased to 57.15%.

Acinetobacter calcoaceticus；bisphenol A；strain identifi cation of；degradation condition

X172

A

1006-1878（2017）02-0189-05

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.02.011

2016 - 08 - 04；

2016 - 12 - 19。

王迪（1991—），女，辽宁省本溪市人，硕士生，电话 13840401260，电邮 13840401260@163.com。联系人：徐成斌，电话 13840149575，电邮 xuchengbin80@163.com。

国家“十二五”科技重大专项子课题（2012ZX072020 03-05）；辽宁省教育厅一般项目（L2015202）；2016年辽宁省级本科教改立项项目。