丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力及海马CA1区超微结构的影响

全红飞 曹金英 胡 琨 邓春颖 张文丽 李海滨 毛文静 李世英

华北理工大学附属医院神经内科一病区;①基础医学院 河北唐山 063000;②唐山市遵化市人民医院心内科

丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力及海马CA1区超微结构的影响

全红飞 曹金英 胡 琨①邓春颖 张文丽①李海滨②毛文静 李世英

华北理工大学附属医院神经内科一病区;①基础医学院 河北唐山 063000;②唐山市遵化市人民医院心内科

①目的 观察丁苯酞(dl-3-n-butylphthalidle，NBP)对阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)模型大鼠学习记忆能力及海马CA1区超微结构的影响，探讨NBP对AD模型大鼠的脑保护作用。②方法 雄性SD大鼠18只，分为假手术组、AD模型组、NBP治疗组。AD组和Treatment组采用β-淀粉样蛋白1-42(beta-amyloidpeople1-42,Aβ1-42 )海马立体定向微量注射的方法建立模型，Sham组采用同样的方法注射生理盐水，4周后Morris水迷宫实验比较3组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数。而后Treatment组给予NBP溶液进行灌胃；Sham及AD组采用同等剂量食用油灌胃，2次/d。2w后进行Morris水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力，电镜下观察各组大鼠海马CA1区超微结构的改变。 ③结果 4周时与Sham组比较，AD组和Treatment组逃避潜伏期明显延长、穿越平台次数明显减少(P<0.05)；AD组与Treatment组比较无明显差异(P>0.05)。6周时与Sham组比较，AD组和Treatment组逃避潜伏期显著延长、穿越原平台位置次数减少(P<0.05)；与AD组相比较，Treatment组逃避潜伏期明显缩短、穿越平台位置次数明显增多(P<0.05)，电镜下可见Treatment组神经元损伤较AD组有所减轻。④结论NBP能够改善AD模型大鼠的学习记忆能力，减轻海马CA1区神经元的受损程度。

阿尔茨海默病 丁苯酞 海马CA1区 超微结构

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，其发病机制复杂，预后差，目前尚无好的治疗方法。目前公认的发病机制有：Aβ神经毒性假说、Tau蛋白假说、胆碱能学说、自由基损伤学说、氧化应激学说、炎症机制等[1]。丁苯酞软胶囊(butylphthalide，NBP)作为治疗缺血性脑血管病的新药，具有良好的抗缺血及脑保护作用。其主要作用机制有：减少钙超载、拮抗自由基、抗凋亡、抑制炎性反应等，从而保护线粒体功能，抑制神经元死亡，发挥脑保护作用。本研究通过观察丁苯酞对AD模型大鼠学习记忆能力及海马CA1区超微结构的影响，探讨丁苯酞对AD模型大鼠的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠18只，体质量220～240g，购自中国人民解放军医疗科学院卫生学环境医学研究所。用随机数字生成器抽取不同数字，将大鼠随机分为假手术组(Sham组，n=6)、AD模型组(AD组，n=6)、丁苯酞治疗组(Treatment组,n=6)，造模成功后，应用Morris水迷宫实验检测学习记忆能力，电镜观察海马区超微结构的改变。

1.2 试剂和仪器 丁苯酞软胶囊：石药集团恩必普药业有限公司。食用油：葵花籽油。Aβ1-42(rat)：TOCRIS公司。透射电镜：日本HITACHI公司。石蜡切片机：OLYMPUS公司。水迷宫：淮北正华生物仪器设备有限公司。脑立体定位仪：STOELTING公司。

1.3 模型制作 未经处理的Aβ1-42为粉末状态，将500μgAβ1-42溶于无菌生理盐水，于离心机上充分混匀后，37℃恒温孵育箱中孵育1周，使其达到凝聚状态。实验前先将所有实验动物通过Morris水迷宫进行初步筛选，通过初筛除去先天性痴呆及游泳姿势不良等不符合实验要求的大鼠。而后将大鼠固定于脑立体定位仪上，剪掉大鼠头顶部毛发并用碘酒消毒，切开皮肤，选择双侧海马CA1区为注射区，以前囟为基准点，向后4.5mm，中线旁开2mm处，用去尖的粗针头钻开其颅骨，暴露大鼠硬脑膜，将微量注射器与脑表面垂直，缓慢进针，深度2mm，AD组及Treatment组均注入5μL聚集态1μg/μLAβ溶液，注射过程中需缓慢注入并留针10分钟，使Aβ1-42 溶液充分在海马处弥散，然后缓慢撤出针头，用骨蜡封闭其颅骨骨质创口，缝合其皮肤切口，手术区滴注硫酸庆大霉素注射液用于消毒。Sham组海马内注射5μL生理盐水。造模4周时进行Morris水迷宫实验检测各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数，造模前后学习记忆能力比较有统计学意义视为模型成功。

1.4 方法Treatment组将丁苯酞稀释在食用油中制成8mg/mL的丁苯酞溶液，按1mL/100g剂量进行灌胃，2次/天；Sham组及AD组采用同等剂量的食用油灌胃，2次/天。药物灌胃2周后再次进行Morris水迷宫实验，而后处死。

1.5 取材及透射电镜检测 各组大鼠用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉后开胸暴露心脏。从心尖插入粗针头至升主动脉，剪开右心耳，快速用生理盐水冲洗，4%多聚甲醛灌流固定。断头取脑，4%多聚甲醛固定72小时，于视交叉后2mm处切取3mm厚脑组织块。将取出的海马组织切成(1×1×1)mm立方体，迅速放置于2.5%戊二醛保存，其余组织置于4%多聚甲醛中固定。置于2.5%戊二醛中的标本送华北理工大学电镜室，铅轴双重染色，于透射电镜下观察。

2 结果

2.1Morris水迷宫实验结果 4周时Morris水迷宫结果显示：①逃避潜伏期结果：实验前2天，3组大鼠逃避潜伏期均较长，在随后3d测试中，3组大鼠逃避潜伏期均有不同程度缩短的趋势，以Sham组为最显著。而AD组和Treatment组均保持较长的逃避潜伏期。与Sham组比较，AD组、Treatment组大鼠的逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；AD组与Treatment组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。②空间探索实验结果：第6天撤去平台后，3组大鼠穿越原平台位置次数测试显示：与Sham相比较，AD组和Treatment组大鼠穿越原平台位置次数明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)；AD与Treatment组比较，大鼠穿越平台位置次数无明显变化，差异不具有统计学意义(P>0.05)。见表1、2。

表1 4周时各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期结果比较

注：与Sham组比较，*P<0.05

表2 4周时各组大鼠空间探索试验中穿过原平台位置次数结果比较

注：与Sham组比较，*P<0.05

6周时Morris水迷宫结果显示：①逃避潜伏期结果：3组大鼠逃避潜伏期在5天内均呈下降趋势，但AD组大鼠下降趋势最小。与Sham组比较，AD组和Treatment组大鼠逃避潜伏期延长，差异有统计学意义(P<0.05)；与AD组比较，Treatment组大鼠的逃避潜伏期缩短，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。空间探索实验结果：与Sham组比较，AD组和Treatment组大鼠穿越平台位置次数减少，且差异具有显著性(P<0.05)。但Treatment组大鼠穿越平台位置次数多于AD组，差异具有显著性(P<0.05)，见表3、4。

表3 6周时各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期结果比较

注：与Sham组比较，*P<0.05；与AD组比较，#P<0.05

表4 6周时各组大鼠空间探索试验中穿过原平台位置次数结果比较

注：与Sham组比较，*P<0.05；与AD组比较，#P<0.05

2.2 超微结构改变 透射电镜下发现，Sham组大鼠海马CA1区神经细胞呈圆形或卵圆形，细胞核较大，线粒体及粗面内质网结构清楚，线粒体嵴清晰可见，核糖体丰富。AD组大鼠海马CA1区神经元出现不同程度的退行性改变，细胞核形态不规则，细胞器显示不清，结构破坏，数目明显减少，内质网扩张，线粒体数目减少，线粒体肿胀甚至出现线粒体膜破裂，线粒体嵴缺失甚至消失，核糖体稀疏，核周间隙明显较Sham组变宽。与AD组相比较，Treatment组海马CA1区神经细胞核核染色质分布较均匀，线粒体、粗面内质网较模型组清晰，核糖体较丰富核周间隙较AD组明显变窄。见图1。

图1 各组大鼠海马CA1区超微结构的变化(6000×)

3 讨论

AD是典型的神经退行性疾病，表现为进行性的智能减退，以记忆力减退为首发症状，伴随着颞叶、海马区的萎缩，病理组织学改变包括老年斑的形成、神经元纤维缠结、神经元缺失、胶质增生等。针对其发病机制，目前的治疗药物包括胆碱能制剂、NMDA受体拮抗剂以及脑代谢复活剂等，但价格相对昂贵，短期内效果不明显，患者服药依从性差。

NBP是我国自主研制国家一类新药，具有良好的抗缺血及脑保护作用[2,3]。另外，目前研究发现NBP还可以抑制神经元凋亡、拮抗炎性反应，从而保护受损的脑细胞[4]。大量临床研究资料表明，NBP可能对老年痴呆患者也有一定的疗效[5,6]。本实验采用双侧海马立体定向注射Aβ1-42的方法制作AD大鼠模型[7,8]，4周后进行Morris水迷宫试验，结果提示：AD组和NBP干预前的Treatment组大鼠逃避潜伏期明显延长，与Sham组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；AD组与Treatment组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；第6天撤去平台后，空间探索试验结果提示：AD组和NBP干预前的Treatment组大鼠穿越原平台位置次数较Sham组明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)；AD与Treatment组间比较差异不具有统计学意义(P>0.05)。说明大鼠AD模型制备成功，AD组与Treatment组具有可比性。NBP后处理2周后，Morris水迷宫试验结果提示：Treatment组大鼠的逃避潜伏期较AD组缩短，穿越原平台位置次数多于AD组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。说明NBP能改善AD大鼠的学习记忆能力。

另外，笔者通过透射电镜观察大鼠海马CA1区超微结构改变，结果发现：AD组大鼠海马CA1区神经元出现不同程度的退行性改变，表现为核形态不规则，核周间隙明显变宽。细胞器数目明显减少，显示不清，结构破坏，内质网扩张，线粒体肿胀、数目减少，并可见线粒体膜破裂，线粒体嵴缺失，核糖体稀疏，明显区别于Sham组。但经NBP干预后Treatment组海马CA1区神经结构损害较AD组明显减轻。说明NBP对AD模型大鼠海马CA1区神经结构有保护作用。

目前已有动物实验发现NBP对痴呆模型大鼠的保护作用，但多见于血管性痴呆模型。有关AD的研究尚少，且具体机制不甚明确。目前推测其可能发挥的作用机制仍主要有修复损伤的内皮功能，阻断脑组织病理损害环节，增加毛细血管数量，促进微循环重构[9～13]。但目前许多研究发现MAPK信号转导通路与AD的发生与发展有关[14]，我国学者发现Aβ1-42的沉积可导致P38MAPK的活化，给予NBP干预后P38MAPK的活性明显降低，推测NBP可能通过抑制MAPK途径介导的炎症及凋亡反应，延缓AD的进程。今后，笔者将进一步研究NBP对AD模型大鼠的脑保护作用机制，为疾病的治疗提供实验依据。

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(2017-01-04 收稿)(王一伊 编辑)

EffectofbutylphthalideonabilityoflearningandmemoryandultrastrureinhippocampusCA1regionofalzheimer'sdiseasemodelrats

QUANHongfei,CAOJinying,HUKun,etal

(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To explore neural protection of dl-3-n-butylphthalidle(NBP) in Alzheimer's disease(AD)model rats by observing the effect on learning and memory ability and the ultrastrure in hippocampal CA1 region.Methods 18 male SD rats were randomly divided into three groups:sham operation group,AD model group,NBP treatment group.Animal models of AD group and the Treatment group were established with 5ug beta-amyloid 1-42 by Stereotactic microinjection of bilateral hippocampus,and the Sham group with equel sailine.After 4 weeks,Morris water maze experiment were tested,compared by escape latent period and numbers of cross platform of rats in three groups.Then the treatment group were given NBP by intragastric administration,and the Sham group and the AD group treated oniy by the same dose of cooking oil,2 times a day.Another 2 weeks later,Morris water maze experiment were tested again to detect the ability of learning and memory,the change of ultrastrure of rats in hippocampal CA1 region by electron microscope were observed.Results In the forth week,Morris water maze experiment showed that the escape latent period of rats in the AD

group and the Treatment group prolonged significantly,the number of cross platform in the two groups reduced(P<0.05).Compared with the AD group,there was no statistically significance in the Treatment group(P>0.05).At 6th week, Morris water maze experiment showed that the escape latent period of rats in the AD group and the Treatment group prolonged significantly,the number of cross platform in the two groups reduced(P<0.05).Compared with the AD group,escape latent peroid of rats in the Treatment group shorten significantly,whereas the number of cross platform of rats in the Treatment group exceeded obviously(P<0.05).Compared with the AD group,the electron microscope showed that in hippocampal CA1 region nerve damage of the Treatment group relieved.Conclusion NBP can improve the ability of learning and memory,reduce the nerve cell damage in hippocampal CA1 region of AD model rats.

Alzheimer disease. Butylphthalide.Hippocampal CA1 region.Ultrastrure

全红飞(1998-)，女，硕士研究生。研究方向：老年痴呆。

李世英。

R

A

2095-2694(2017)03-177-05