氯吡格雷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制

2017-06-15张亚雯张宇明

中国老年学杂志 2017年10期

关键词：行为障碍阳性细胞脑缺血

张亚雯时红张宇明王玲刘玲

(河北医科大学第三医院脑血流图室，河北石家庄 050051)

氯吡格雷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制

张亚雯时红张宇明王玲刘玲

(河北医科大学第三医院脑血流图室，河北石家庄 050051)

目的探讨氯吡格雷干预大鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)损伤模型的神经保护机制。方法选取Wistar大鼠，随机分为假手术(Sham)组，I/R组及治疗组(给予氯吡格雷干预)，观察各组大鼠行为障碍、脑梗死面积、含水量，组织病理学改变及半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、程序化细胞死亡分子(PDCD)-5表达情况。结果在神经功能评分方面，与Sham组相比，I/R组及治疗组评分显著升高(P<0.05)；与I/R组相比，治疗组显著降低(P<0.05)。在脑梗死面积及含水量方面，与Sham组相比，I/R组及治疗组均显著升高(P<0.05)；与I/R组相比，治疗组均显著降低(P<0.05)。在组织病理学方面，Sham组海马CA1区细胞结构完整，细胞核、核膜及核仁结构完整；I/R组细胞排列紊乱，水肿严重，核膜界线不清晰，血管充血严重；相比于I/R组，治疗组间质水肿缓解，细胞结构较完整。在Caspase-3及PDCD-5表达方面，Sham组基本未见Caspase-3及PDCD-5阳性细胞；I/R组随处可见大量Caspase-3及PDCD-5阳性细胞；相比于Sham组，治疗组Caspase-3及PDCD-5阳性细胞含量明显增加，但相对于I/R组含量明显降低。结论氯吡格雷可通过缩小梗死面积、减轻水肿情况抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子的生成而保护神经功能，改善缺血性脑卒中疾病的进展。

氯吡格雷；缺血再灌注损伤；半胱氨酸蛋白酶；程序化细胞死亡分子(PDCD)-5；细胞凋亡

目前，缺血性脑卒中没有明确的致病机制，但尽早地恢复脑血流是治疗疾病的根本〔1〕。针对缺血性脑卒中的动物模型——脑缺血再灌注(I/R)损伤模型的研究发现，最大程度地抑制凋亡保护神经是治疗的关键。研究证实，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是与凋亡关系最为密切的因子之一，可水解底物蛋白，降解细胞内产物，导致染色体断裂，最终使细胞走向死亡，其中Caspase-3是该家族中最为关键的因子〔2〕。程序化细胞死亡分子(PDCD)-5是近来研究与凋亡相关的因子，在多种疾病中起着重要作用〔3〕。氯吡格雷作为血小板聚集抑制剂，广泛地应用于脑梗死的临床治疗中，然而有关其神经保护机制仍然不清楚。本研究建立大鼠I/R模型，体外给予氯吡格雷干预，观察其对模型的神经保护机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物及分组 Wistar大鼠120只购于北京华阜康生物公司，随机分为假手术(Sham)组、I/R组、治疗组(I/R后给予氯吡格雷治疗)，每组40只。其中治疗组在大鼠造模完成后次日给予7.71 mg·kg-1·d-1的氯吡格雷(赛诺菲制药有限公司)灌胃治疗。

1.2 动物模型构建参考相关文献〔4〕，建立I/R模型。7.2%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剪开鼠头部皮肤，颈正中切口，分离颈外动脉(ECA)、右侧颈总动脉(CCA)及颈内动脉(ICA)。在远处结扎ECA，并在主干上剪一小口，将线栓插入，使其经ECA至CCA，插入长度为17～18 mm，直至感觉有阻力时停止，从而形成脑缺血模型，缝皮将大鼠安置于温暖之处。2 h后打开伤口拔出线栓，使血流恢复，从而造成再灌注模型。造模成功的标准为大鼠出现以右前肢为重的偏瘫及右侧Horner征。Sham组操作同上，仅暴露各组血管，而不进行线栓插入。

1.3 行为障碍评分给药3 d后，对大鼠进行行为障碍评分，评分标准参照相关文献〔4〕，为4分制。0分：未见相关行为障碍；1分：左侧前爪无力；2分：推手术侧肩部，可发觉对侧的移动阻力降低；3分：大鼠出现旋转、转圈及行动歪倒；4分：无肢体活动；分值越高说明行为障碍越重。

1.4 脑梗死面积检测断头取大鼠脑组织，并做脑冠状切片，应用噻唑蓝(TTC)染色测定，按照脑梗死区占整个脑切片的百分比测定脑梗死面积。

1.5 脑含水量测定断头取大鼠脑组织，称量湿质量，置于110℃烤箱中烘烤48 h后称量干质量，脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.6 脑组织病理形态检测断头取大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，包埋，切片后进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察脑组织形态。

1.7 免疫组化检测Caspase-3及PDCD-5的表达将石蜡切片脱蜡，二甲苯透明，梯度酒精脱水，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，抗原修复，添加Caspase-3及PDCD-5一抗(购于CST公司)过夜孵育，第2天二抗孵育，室温静置2 h，PBS清洗，二氨基联苯胺(DAB)及苏木精染色，清洗后封片显微镜观察。

1.8 统计学方法应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 行为障碍评分与Sham组〔(0.19±0.26)分〕相比，I/R组及治疗组神经功能评分〔(3.11±0.87)分、(2.09±0.71)分〕显著升高(P<0.05)；与I/R组相比，治疗组显著降低(P<0.05)。

2.2 脑梗死面积及含水量比较与Sham组相比，I/R组及治疗组脑梗死面积及含水量显著升高(P<0.05)；与I/R组相比，治疗组显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3 组织病理学改变 Sham组大鼠海马CA1区细胞结构完整，细胞核、核膜及核仁结构完整；I/R组细胞排列紊乱，水肿严重，核膜界线不清晰，血管充血严重；相比于I/R组，治疗组间质水肿较前缓解，细胞结构较完整。见图1。

2.4 Caspase-3及PDCD-5表达变化光镜下，Caspase-3、PDCD-5阳性细胞呈现棕黄色或黄褐色。Sham组基本未见Caspase-3、PDCD-5阳性细胞；I/R组随处可见大量Caspase-3、PDCD-5阳性细胞；相比于Sham组，治疗组含量明显增加，但相对于I/R组，治疗组含量明显降低。见图2，图3。

表1 各组脑梗死面积及含水量比较

与Sham组比较：1)P<0.05;与I/R组比较：2)P<0.05

图1 各组大鼠HE染色

图2 各组脑组织Caspase-3表达(×400)

图3 各组脑组织PDCD-5表达(×400)

3 讨论

尽管I/R大鼠体内存在多种发病机制，如炎症、水肿、钙超载等，然而最快及最早地恢复血流量仍是各种疾病治疗的关键。若不及时给予相应治疗，缺血缺氧加重，就会造成缺血组织及细胞的凋亡和坏死，从而导致功能的不可逆性损伤。细胞凋亡是一种有序性的细胞死亡，是受多种基因调控的细胞正常死亡〔5〕。已有研究表明，主要有3条信号通路可以干预凋亡：(1)线粒体凋亡通路；线粒体是细胞内主要产能细胞器，为细胞的各种功能和稳态的维持提供能量。该凋亡通路中重要的因子为细胞色素C及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路相关蛋白，接收到凋亡信号刺激后，细胞质内凋亡蛋白释放，激活下游Caspase-3、PDCD-5等凋亡蛋白，从而诱发了细胞的程序性死亡〔6〕。(2)内质网凋亡途径：病理因素可导致内质网中Caspase-12的高表达，从而诱发Caspase-3、PDCD-5等凋亡分子的激活〔7〕。(3)死亡受体通路：多种体外刺激物激活死亡受体，从而诱导细胞内Caspase-3等效应酶，从而引起细胞凋亡〔8〕。在多种凋亡通道中，Caspase-3处于凋亡系统的中心环节，多种因子及通道均可激活Caspase-3分子，从而启动细胞凋亡。Caspase-3降解底物的活性最强，活化的分子尽在凋亡细胞中表达，是反映细胞凋亡的重要因子〔9〕。PDCD-5是新近发现的凋亡因子，其在凋亡过程中起着早期及始动性的功能，PDCD-5可诱发线粒体凋亡通路〔10〕。氯吡格雷作为一种血小板受体阻断剂，因为较小的副作用广泛应用临床，然而有关其神经保护机制仍然不清楚。本实验说明氯吡格雷在I/R大鼠模型中可改善脑部水肿及梗死情况，可较大程度减缓I/R的损伤。本实验结果还提示氯吡格雷可通过降低Caspase-3及PDCD-5凋亡因子来干预疾病进程，较大程度减低神经细胞的凋亡情况，与国内报道〔11〕相符。

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3 鲍晓蕾,潘留兰,杨丽,等.凋亡相关基因PDCD5在胃癌组织的表达及临床意义〔J〕.中国实用医药,2016;11(9):63-4.

4 李红,张爽,纪影实,等.山楂叶总黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中草药,2010;41(5):794-8.

5 吴向征,张倩,梁男男,等.TXNIP过表达对INS-1细胞凋亡通路的影响〔J〕.中国心血管病研究,2016;14(2):185-92.

6 姜福琼,王剑松,邓丹琪,等.植物药提取物影响肿瘤细胞凋亡信号通路的研究进展〔J〕.云南中医中药杂志,2015;36(3):87-91.

7 潘圆未,平键,徐列明,等.诱导活化肝星状细胞凋亡主要信号通路的研究进展〔J〕.临床肝胆病杂志,2014;30(2):182-5.

8 邱志凌,张军平,郭晓辰,等.内质网应激与血管内皮细胞凋亡的研究进展〔J〕.中国医学科学院学报,2014;36(1):102-7.

9 李莉,古正涛,刘志锋,等.Caspase-3在热打击诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用〔J〕.实用医学杂志,2014;30(6):871-4.

10 张晓璇,李佳佳.丁苯酞对脑缺血再灌注大鼠凋亡情况的影响〔J〕.中国实用神经疾病杂志,2014;17(14):44-6.

11 钟文娟.脑心通联合双联抗栓防治冠脉内微栓塞的动物实验研究〔D〕.福州：福建医科大学,2010.

〔2017-01-10修回〕