基于不同脑区的川芎-冰片配伍对脑缺血大鼠的保护作用及其与冰片剂量的相关性

喻 斌 梁 涛 黄仕文 杨 丽

(南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点实验室 部省共建中药药理实验室，江苏 南京 210023)

基于不同脑区的川芎-冰片配伍对脑缺血大鼠的保护作用及其与冰片剂量的相关性

喻 斌 梁 涛 黄仕文 杨 丽

(南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点实验室 部省共建中药药理实验室，江苏 南京 210023)

目的 探讨不同剂量冰片与川芎配伍对全脑缺血再灌注大鼠不同脑区的抗氧化效应和对微循环的改善及其效应与冰片剂量的相关性。方法 复制大鼠全脑缺血-再灌注模型，观察不同剂量冰片(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28 g/kg)联合川芎对大鼠皮层、海马、下丘脑和纹状体四个脑区微循环、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)的影响。结果 川芎配伍冰片后对脑组织微循环、SOD、CAT、GSH-PX、MDA、ROS、iNOS和NO含量的改善均显著优于单用。皮层引发显著改善作用的冰片剂量范围最广，然后是海马、下丘脑、纹状体。冰片剂量对配伍效果的比较为0.16 g/kg>0.08 g/kg>0.32 g/kg>0.04 g/kg。结论 川芎和冰片配伍可以对缺血脑组织产生脑区特异性改善，而且这一改善作用与冰片剂量密切相关。

川芎；冰片；脑区特异性；脑缺血

川芎、冰片配伍来自宋《圣济总录》卷十五“清神散”化裁而来，后者由川芎、莎草根、石膏、冰片四味药组成，主治脑中风、头痛等症〔1〕。近年来临床和实验研究均表明川芎-冰片配伍对脑缺血具有显著治疗作用，并且优于川芎单独治疗〔2〕。在前期研究发现冰片对栀子苷的分布具有脑区特异性，这种特异性和其给药剂量密切相关〔3〕。本次研究拟探索不同剂量冰片与川芎配伍对脑缺血的保护作用是否具有脑区特异性。

1 材料和方法

1.1 材料 冰片和川芎均购于江苏省中医院，尼莫地平购于拜耳医药保健有限公司(批号：6924147652011)，总蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号分别为20160107、20160106、20160105、20160105、20151211、20151215、20151225、20160105)。Synergy型荧光酶标仪(美国BIOTEC公司)，MP100型生理记录仪及其微循环附件(美国BIOPAC公司)，XHF-D组织分散器(宁波新芝生物科技公司)，IX71型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)。雄性SD大鼠(250～300 g)，购于浙江省实验动物中心，动物合格证号SCXK(浙)2014-0001。

1.2 方法

1.2.1 川芎提取物的制备 川芎药材1 000 g，粉碎后过40目筛。50%乙醇回流提取2 h(20 ml/g)，减压浓缩后用生理盐水稀释至10 L，用于本次实验。

1.2.2 造模、给药和检测方法 按照文献方法进行4-动脉阻断法复制全脑缺血模型〔4〕。麻醉大鼠，颈正中切口并分离双侧颈总动脉。颈背部正中切口，分离肌层，暴露第一颈椎横突翼孔，直视下电凝其下通过的椎动脉，使双侧椎动脉永久闭塞。术后大鼠缝皮回笼。24 h后用无创小动脉夹夹闭双侧颈总动脉，造成全脑缺血。缺血20 min，松开动脉夹再灌注。按照Pulsineli报道确定模型成功标准。将造模成功的大鼠分为11组，每组6只：模型组、阳性组(尼莫地平10.8 mg/kg)、川芎组(川芎1.0 g/kg)和川冰Ⅰ～Ⅷ组 (1.0 g/kg的川芎分别配伍0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28 g/kg 冰片)，另制备假手术组6只。模型组和假手术组给予生理盐水(NS)。连续给药7 d后，动物麻醉固定于脑立体定位仪，根据各脑区的立体定位坐标(皮层AP +3.2 mm，ML+0.8 mm，DV-3.0 mm，海马AP-3.8 mm，ML+2.0 mm，DV-3.0 mm，纹状体AP-2.0 mm，ML+3.0 mm，DV-3.5 mm，下丘脑AP-2.0 mm，ML +0.4 mm，DV-8.2 mm)，用牙科钻于各脑区测定点开颅，采用MP100型十六导生理记录仪及其激光多普勒模块完成各脑区微循环测定。处死大鼠，取脑，NS淋洗后滤纸吸干，制备1%脑匀浆。匀浆液4℃离心，取上清液按照说明书要求，利用比色法进行总蛋白、SOD、CAT、GSH-PX、MDA、iNOS和NO的检测。另取上清，加入二氨荧光黄二乙酸酯(DCFH-DA)，利用荧光酶标仪进行ROS检测(激发波长为500 nm，发射波长为525nm)。

1.3 统计学方法 应用GraphPad Prism5进行绘图，利用SPSS13.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 川芎、冰片配伍对皮层区域缺血再灌注的保护作用 与假手术组比较，模型组可见皮层区微循环、MDA、ROS、iNOS和NO含量显著升高，SOD、CAT、GSH-PX明显降低(P<0.01)，尼莫地平可显著改善以上微循环和氧化指标(与模型组比较，P<0.01)。川芎单用能显著改善微循环和SOD、MDA和iNOS含量(与模型组比较，P<0.05)，但对其他指标未见显著改善。川芎合用冰片后，除了微循环、SOD和MDA的改善，还能进一步增加CAT、GSH-PX，减少ROS和NO含量(与模型组比较，P<0.05，P<0.01)，显示比单用川芎更好的效果。见表1。

表1 各组不同剂量冰片配伍川芎对脑缺血再灌注大鼠皮层各指标的影响±s，n=6)

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2 川芎、冰片配伍对海马区域缺血再灌注的保护作用 与假手术组比较，模型组可见皮层区微循环、MDA、ROS、iNOS和NO含量显著升高，SOD、CAT、GSH-PX明显降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可显著改善以上微循环和氧化指标(与模型组比较，P<0.05，P<0.01)。川芎仅显著改善SOD含量(与模型组比较，P<0.05)，对其他指标均未见显著改善，但有改善趋势。合用冰片后，还能进一步增加微循环、CAT、GSH-PX，减少MDA、ROS、iNOS和NO含量(与模型组比较，P<0.05，P<0.01)，显示比单用川芎更好的效果。见表2。

2.3 川芎、冰片配伍对下丘脑区域缺血再灌注的保护作用 与假手术组比较，模型组可见皮层区微循环、MDA、ROS、iNOS和NO含量显著升高，SOD、CAT、GSH-PX明显降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可显著改善除微循环和SOD以外的其他指标(与模型组比较，P<0.05，P<0.01)。川芎单用仅显著减少MDA含量(与模型组比较，P<0.05)，对其他指标均未见显著改善。合用冰片后，还能进一步增加微循环、SOD、CAT、GSH-PX，减少ROS、iNOS和NO含量(与模型组比较，P<0.05，P<0.01)，显示比单用川芎更好的效果。见表3。

2.4 川芎、冰片配伍对纹状体区域缺血再灌注的保护作用 与假手术组比较，模型组可见皮层区微循环、MDA、ROS、iNOS和NO含量显著升高，SOD、CAT、GSH-PX明显降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可显著改善除ROS以外的其他指标(与模型组比较，P<0.05，P<0.01)。川芎单用仅显著减少iNOS含量(与模型组比较，P<0.05)，对其他指标均未见显著改善。合用冰片后，还能进一步增加微循环、SOD、GSH-PX，减少NO含量(与模型组比较，P<0.05，P<0.01)，但对CAT、MDA和ROS未见显著改善，但仍显示比单用川芎更好的效果。见表4。

2.5 与川芎配伍产生改善作用的冰片剂量 见表5。皮层引发显著改善作用的冰片剂量范围最广，然后是海马、下丘脑、纹状体。冰片剂量对配任效果的比较为0.16 g/kg、0.08 g/kg、0.32 g/kg、0.04 g/kg。

表2 不同剂量冰片配伍川芎对脑缺血再灌注大鼠海马各指标的影响±s，n=6)

表3 不同剂量冰片配伍川芎对脑缺血再灌注大鼠下丘脑各指标的影响±s，n=6)

表4 不同剂量冰片配伍川芎对脑缺血再灌注大鼠纹状体各指标的影响±s，n=6)

表5 与川芎配伍产生改善作用的冰片剂量范围(g/kg)

括号中剂量为效果最佳剂量

3 讨 论

与其他组织相比，大脑对缺氧最为敏感。生理状态下内源性氧自由基的产生和消除处于平衡。但是在缺血状态下，尤其是缺血后的再灌注，该平衡被打破，大量的自由基可损伤细胞，通过炎症级联反应引起神经元的死亡〔5〕，因此普遍认为缺血再灌注造成的脑损伤比单纯性脑缺血更加严重。临床由于溶栓治疗，前者更为常见。ROS和MDA通常用于评价细胞的氧化损伤，并且它们升高能很好反映神经元的损伤程度〔6〕。SOD、CAT、GSH-PX作为清道夫能消除氧自由基，避免细胞的氧化损伤。显然，这些自由基清除剂活性的增高对于抗脑缺血损伤至关重要。NO作为一种活泼的自由基，既能作为神经信息分子发挥作用，也可成为神经毒性物质。脑缺血后，升高的细胞内钙刺激NO的合成增加。作为逆向神经递质，NO能介导产生氧自由基和花生四烯酸，引起自由基反应，导致神经元死亡。缺血或缺血后再灌注可诱导不依赖Ca2+的iNOS的产生，而选择性抑制iNOS具有神经保护作用。

尽管川芎的抗脑缺血作用已被证实，但是单独用于脑缺血的临床治疗还很少报道。川芎和冰片联合用于脑缺血患者已被证实具有临床意义，因此对这一组合的研究更有必要。冰片作为“芳香开窍”中药，广泛用于中枢神经系统疾病的组方。有学者发现其也具有一定的抗脑缺血作用，并且这一作用与抑制凋亡级联反应和前炎症因子的释放有关〔7〕。虽然大脑作为一个整体在调节机体生理功能中有重要作用，但越来越多的研究发现各脑区的病理损伤和治疗后功能恢复均具有明显的脑区特异性。2006年就有报道iNOS介导的脑缺血炎症反应在皮层区域明显强于纹状体〔8〕。还有学者发现脑部炎症反应中，白细胞介素(IL)-1β，A类清道夫受体(SRA)，Toll样受体(TLR)2，TLR4，GSH、谷氨酸含量以及细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸酶活性的改变也具有显著的脑区特异性〔9～11〕。

本次研究中观察了川芎单用及配伍不同剂量的冰片对皮层、海马、下丘脑和纹状体四个脑区组织的缺血保护作用，发现配伍治疗后的疗效均优于川芎单用，而且两药配伍并不是冰片剂量越大越好，而是仅仅局限在一定范围。结果表明，冰片的剂量与该组合的疗效密切相关，这种相关性分为两个方面：(1)若对引发显著改善作用的冰片剂量范围与各脑区综合分析，则发现皮层区引发显著改善作用的冰片剂量范围最广，海马次之，然后是下丘脑，最后是纹状体。(2)对产生最佳疗效的频次和对应的冰片剂量进行分析，我们发现0.16 g/kg引发最佳疗效的频次最多，其次分别是0.08 g/kg、0.32 g/kg、0.04 g/kg，冰片其他剂量均不能产生最佳疗效。以上分析提示，川芎和冰片配伍可以对缺血脑组织产生脑区特异性改善，而且这一改善作用与冰片剂量密切相关。

1 刘一桢，曲韵智.川芎与冰片伍用的现代研究进展〔J〕.黑龙江医药，2011；24(6)：940-2.

2 徐慧聪.芎冰喷雾剂对椎-基底动脉供血不足的即时疗效〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2006；4(5)：388-90.

3 董小平，阮 鸣，喻 斌，等.不同剂量冰片对栀子苷在大鼠脑内浓度的影响〔J〕.中草药，2012；43(7)：1366-70.

4 Shao ZQ，Liu ZJ.Neuroinflammation and neuronal autophagic death were suppressed via Rosiglitazone treatment：new evidence on neuroprotection in a rat model of global cerebral ischemia〔J〕.J Neurol Sci，2015；349(1-2)：65-71.

5 Saad MA，Abdelsalam RM，Kenawy SA，etal.Ischemic preconditioning and postconditioning〔J〕.Chem Biol Interact，2015；232(1)：21-9.

6 Mansoorali KP，Prakash T，Kotresha D，etal.Cerebroprotective effect of Eclipta alba against global model of cerebral ischemia induced oxidative stress in rats〔J〕.Phytomedicine，2012；19：1108-16.

7 Almeida JR，Souza GR，Silva JC，etal.Borneol，a bicyclic monoterpene alcohol，reduces nociceptive behavior and inflammatory response in mice〔J〕.Scient World J，2013;2013:808460.

8 童秋玲，许国英，陈龙飞，等.亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同脑区iNOS表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2006；23(5)：558-60.

9 Ho Y，Logue E，Callaway CW，etal.Different mechanisms account for ERK activation in distinct brain regions following global ischemia and reperfusion〔J〕.Neuroscience，2007；145(11)：248-55.

10 Michalski D，Härtig W，Krügel K，etal.Region-specific expression of vesicular glutamate and GABA transporters under various ischaemic conditions in mouse forebrain and retina〔J〕.Neuroscience，2013；231(3)：328-44.

11 Noh H，Jeon J，Seo H.Systemic injection of LPS induces region-specific neuroinflammation and mitochondrial dysfunction in normal mouse brain〔J〕.Neurochem Int，2014；69(1)：35-40.

〔2016-05-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

The anti-ischemia effect of different dose of borneol combining with Chuanxiong Rhizoma on the global cerebral ischemia rats in different brain regions

YU Bin, LIANG Tao, HUANG Shi-Wen,etal.

Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

Objective To research the anti-ischemia effect of different dose of borneol combining with Chuanxiong Rhizoma on the global cerebral ischemia/reperfusion rats in different brain regions.Methods After the model of cerebral ischemia-reperfusion was established, the effect of CR, combining with different dose of borneol, was evaluated by levels of microcirculation, SOD, CAT, GSH-PX, MDA, ROS, iNOS and NO.Results Combining therapies of CR and borneol showed obvious better improvements than monotherapy of CR on microcirculation, SOD, CAT, GSH-PX, MDA, ROS, iNOS and NO. Moreover, the comparison of their therapies according to the brain regions were cortex>hippocampus>hypothalamus>striatum. The comparison of their therapies according to the borneol's dose were 0.16 g/kg>0.08 g/kg >0.32 g/kg>0.04 g/kg.Conclusions The combining therapy of CR and borneol induces a better improvement than monotherapy of CR with a region-specificity manner, which is closely related to the dose of borneol.

Chuanxiong Rhizoma; Borneol; Cerebral region-specificity; Cerebral ischemia

国家自然科学基金项目(81573713，81001651)；江苏省自然科学基金(BK20151564)；江苏省大学生创新性实训项目；江苏高校优势学科建设工程资助项目

喻 斌(1978-)，男，博士，副教授，主要从事中药药理学研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)10-2352-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.005