丹皮酚预处理抑制MPP+诱导的BV2小胶质细胞激活的作用研究

王浩 张震中 李中春 赵冰

丹皮酚预处理抑制MPP+诱导的BV2小胶质细胞激活的作用研究

王浩 张震中 李中春 赵冰

目的 探讨丹皮酚（Pae）预处理抑制1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）诱导的BV2小胶质细胞激活的作用及机制。方法 以MPP+刺激的BV2小胶质细胞建立帕金森病细胞模型，以不同浓度的Pae预处理BV2小胶质细胞，采用CCK-8、免疫细胞荧光法、ELISA分别检测BV2小胶质细胞增殖活性、吞噬活性和炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的释放。结果 与对照组比较，MPP+0.1μmol/L可明显诱导BV2小胶质细胞的激活，促进BV2小胶质细胞增殖活性、吞噬活性的增强以及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放（均P＜0.01）。与MPP+组比较，MPP++Pae（5、25μmol/L）组预处理后MPP+诱导的BV2小胶质细胞增殖活性、吞噬活性明显减弱，BV2小胶质细胞释放的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6明显减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。 结论 MPP+可诱导BV2小胶质细胞激活，促进细胞增殖、吞噬活性增强以及炎症因子释放；经MPP++Pae（5、25μmol/L）预处理后，可抑制以上效应，推测与抑制小胶质细胞吞噬活性及抗炎作用有关。

丹皮酚 帕金森病 小胶质细胞 炎症因子

帕金森病（parkinson disease，PD）是常见的中枢神经系统退行性疾病，尤其在60岁以上人群中发病率达1%～2%，黑质纹状体通路多巴胺能神经元的渐进性和选择性缺失是其主要病理特征[1]。目前PD确切的发病机制尚不清楚，临床上缺乏控制病程进展的有效治疗措施，主要采取对症治疗；因此，深入探讨PD发病机制并寻找有效的治疗药物十分迫切[2]。丹皮酚（Pae）是从毛莨科植物牡丹干燥根皮与萝摩科植物徐长卿中提取的单体，在中枢神经系统的药理作用十分广泛[3]。有研究表明Pae对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD小鼠具有保护作用[4]；本课题组既往研究表明Pae对鱼藤酮、1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）损伤的神经元具有保护作用[5]。小胶质细胞是中枢免疫神经的炎症细胞，维持神经元微环境的动态平衡。由于小胶质细胞介导的神经炎症和氧化应激损伤被公认为是PD发病的重要机制[6]，因此，笔者以BV2小胶质细胞为研究对象，探究Pae对MPP+诱导的小胶质细胞激活的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器 BV2小胶质细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胎牛血清购自中国杭州四季青生物有限公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；MPP+购自美国 Sigma公司；Pae注射液（10mg/2ml）购自中国上海第一生化药业有限公司，实验时用DMEM培养液配置，无菌过滤，4℃保存备用；小鼠IL-1βELISA试剂盒购自美国R＆D公司；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自中国武汉博士德公司；荧光微球购自美国Inventrogen公司；兔抗 Iba-1抗体购自日本Wako公司；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG抗体购自Millipore公司；CCK-8试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；BX51型倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；Elx800型酶标仪购自美国Bio-TEK公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理 BV2小胶质细胞冻于液氮中，实验时常规复苏。在37℃、5%CO2的培养箱中，用含10%灭活胎牛血清的高糖型DMEM培养液复苏，细胞汇集至80%时进行传代接种，选取对数生长期的细胞进行实验。实验分为对照组、MPP+组、MPP++Pae（1、5、25μmol/L）组，共5组。细胞接种于96孔板上，接种密度为1×105/ml；选择细胞贴壁形态且生长状态良好者用于实验；培养24h后加入不同浓度的Pae，在37℃、5% CO2的培养箱内培养1h后；对照组加入培养基，其他4组分别加入含0.1μmol/LMPP+的DMEM培养基，维持至实验结束。

1.2.2 CCK-8法检测BV2小胶质细胞增殖活性 取出培养板，每孔加入10μl CCK-8反应液，在5%CO2孵箱中，37℃反应10min后，使用酶标仪检测450nm处样品吸光度值（OD450），用于计算细胞增殖活性。

1.2.3 免疫细胞荧光法检测BV2小胶质细胞吞噬活性 取出培养板，加入荧光微球（直径1μm）作用1h。实验完毕当天，0.01mol/L PBS冲洗5min×3次；非免疫羊血清封闭2h，吸干；加入一抗工作液（兔抗人Iba-1抗体，1∶1 000），置于4℃湿盒中孵育过夜。第2天用0.01mol/L PBS冲洗后加入FITC标记的羊抗兔荧光二抗（IgG，1∶200）室温避光孵育2h，0.01mol/L PBS冲洗后甘油-碳酸盐缓冲液（含DAPI）封片；荧光显微镜下扫描记录并保存图像，用于计算BV2小胶质细胞的吞噬指数（PI）。PI=吞噬荧光微球的细胞数/细胞总数×100.00%；吞噬指数越高，表明BV2小胶质细胞的吞噬活性越强。

1.2.4 ELISA检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6释放水平 收集上清液及细胞，低温离心后上清液分装至-40℃冰箱内。按试剂盒说明书检测炎症因子的释放水平；同时，将收集的细胞经蛋白裂解液裂解后，按Bradford法进行蛋白定量分析，测定各蛋白提取液中的蛋白浓度，最后折算为每毫克总蛋白中IL-1β、TNF-α、IL-6的释放量。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 预实验结果 以MPP+诱导BV2小胶质细胞激活建立PD细胞模型，预实验结果显示MPP+0.1μmol/L作用24h可明显诱导BV2小胶质细胞激活，引起细胞形态改变（细胞突起变短，胞体变大变圆）、细胞增殖活性增强。进一步检测发现MPP+0.1μmol/L作用24h可增强BV2小胶质细胞吞噬功能，促进炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放；随着MPP+浓度增大，会引起BV2小胶质细胞活性及吞噬功能下降，炎症因子释放水平下调。因此，选择该条件（MPP+0.1μmol/L作用24h）作为诱导BV2小胶质细胞激活改变的条件。

2.2 Pae对MPP+诱导的BV2小胶质细胞增殖活性的影响 与对照组比较，MPP+组小胶质细胞增殖活性明显升高（P＜0.01）；与MPP+组比较，MPP++Pae（5、25μmol/L）组预处理后小胶质细胞增殖活性明显降低（均P＜0.05），见表1。

表1 Pae对MPP+诱导的BV2小胶质细胞增殖活性的影响

2.3 Pae对MPP+诱导的BV2小胶质细胞吞噬活性的影响 正常状态下，吞噬荧光微球的BV2小胶质细胞较少，见图1a。经MPP+处理后，吞噬荧光微球的BV2小胶质细胞数目明显增多，见图1b；与对照组比较，PI明显增大（P＜0.05）。MPP++Pae（5、25μmol/L）组预处理后，吞噬荧光微球的BV2小胶质细胞数目明显减少，见图1d-e；与MPP+组比较，PI均明显降低（均P＜0.05），见表2。

图1 Pae对MPP+诱导的BV2小胶质细胞吞噬活性的影响（a：对照组；b：MPP+组；c：MPP++Pae1μmol/L组；d：MPP++Pae 5μmol/L组；e：MPP++Pae 25μmol/L组）

表2 Pae对MPP+诱导的BV2小胶质细胞吞噬活性的影响

2.4 Pae对MPP+诱导的BV2小胶质细胞炎症因子释放的影响 经MPP+处理后，BV2小胶质细胞释放的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6均较对照组明显增加（均P＜0.05）。与MPP+组比较，MPP++Pae（5、25μmol/L）组预处理后BV2小胶质细胞释放的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6明显减少（均P＜0.05），见表3。

表3 Pae对MPP+诱导的BV2小胶质细胞炎症因子释放的影响

3 讨论

小胶质细胞是脑内的免疫、炎症效应细胞，对中枢神经系统的损伤十分敏感，其激活先于神经元损伤[7]。正常情况下，小胶质细胞呈分枝状，通过细长的突起感受周围微环境的变化并释放细胞因子、生长因子等，以维持神经元的正常功能。损伤后小胶质细胞迅速激活，形态变为丛、杆状或阿米巴样。激活的小胶质细胞受到损伤部位释放的趋化因子吸引，向损伤部位迁徙增殖；轻度损伤早期，小胶质细胞可释放IFN-γ、少量的TNF-α和神经营养因子等，参与神经保护作用；损伤较重时，小胶质细胞早期可释放大量TNF-α、IL-1β等，加重神经损伤；严重损伤早期，激活的小胶质细胞可吞噬死亡细胞及其残片，对损伤的恢复与重建有利，但在大量吞噬的同时，小胶质细胞也会释放大量ROS、TNF-α、IL-1β等细胞毒性分子，加重神经损伤；可见小胶质细胞具有典型的双向调节作用[7-9]。

小胶质细胞的激活在PD神经炎症和多巴胺神经元损伤中起着重要作用。小胶质细胞的异常激活会诱导神经炎症和氧化应激，并引起神经元损伤；损伤的神经元释放毒素，又进一步刺激小胶质细胞大量激活，促进小胶质细胞进一步释放神经毒性因子和免疫因子并且彼此扩大各自毒性，最终引起多巴胺神经元进行性变性死亡，促进PD的发展进程[6,10]。相关研究发现MPTP诱导的PD动物模型中，多巴胺能神经元变性的早期就已经出现明显的小胶质细胞激活[11]。经MPP+处理的小胶质细胞条件培养液可引起多巴胺能神经元损伤，然而抑制小胶质细胞的激活与减少炎症因子的释放可明显减轻神经元损伤[12]。此外，激活的小胶质细胞发挥的吞噬功能对神经元也有损害作用。在6-羟基多巴或鱼藤酮诱导的PD模型中发现黑质多巴胺神经元附近有小胶质细胞吞噬神经元，减弱小胶质细胞的吞噬活性则会减少神经元的丢失[13-14]。因此，调控小胶质细胞的功能对于神经退行性疾病的治疗具有重要意义。

近年来，中药及其活性成分在PD治疗方面显示出一定的效果。Pae是从毛茛科植物牡丹皮、萝藦科植物徐长卿中提取出来的一种中药单体，目前有研究表明Pae具有一定的神经保护作用；（1）减轻脑缺血再灌注损伤，改善血脑屏障通透性，抑制活性氧生成，发挥抗炎作用[15]；（2）减轻阿尔茨海默病动物模型脑内的炎性损伤，有效改善阿尔茨海默病、血管性痴呆动物的认知功能障碍；（3）缓解动物模型的焦虑抑郁[16-18]；（4）抑制内毒素介导小胶质细胞炎症[19]；（5）对PD神经元具有一定的神经保护作用，可减轻鱼藤酮、MPP+诱导的神经元损伤，对MPTP诱导的PD小鼠也有一定的保护作用[4-5]，但目前尚无Pae对小胶质细胞激活作用的文献报道。

由于小胶质细胞介导的神经炎症是PD发病的重要机制，因此本研究以BV2小胶质细胞为研究对象，研究Pae对MPP+诱导的小胶质细胞激活的影响，以探寻一种有效的干预和药物作用的新靶点。本研究结果显示MPP+可诱导BV2小胶质细胞激活，促进细胞增殖、吞噬活性增强以及炎症因子释放；经MPP++Pae（5、25μmol/L）预处理后，可抑制以上效应，推测该作用可能与抑制小胶质细胞吞噬活性及抗炎作用有关。

[1]ForloniG,Artuso V,La Vitola P,etal.Oligomeropathies and pathogenesis of Alzheim er and Parkinson's d iseases[J].Mov Disord,2016,31(6):771-781.

[2]OertelW,Schulz JB.Currentand experimental treatments of P-arkinson d isease:A guide for neuroscientists[J].J Neurochem, 2016,139(Supp l1):325-337.

[3]Lin C,Lin H Y,Chen JH,etal.Effects o fpaeonolon anti-neuroinflammatory responses in m icrog lial cells[J].Int JMolSci,2015, 16(4):8844-8860.

[4]Shi X,Chen Y H,Liu H,et al.Therapeutic effects of paeono l on methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahyd ropyrid ine/p robenecid-induced Parkinson's d isease in m ice[J].MolMed Rep,2016,14(3): 2397-2404.

[5]王浩,耿赵铭,胡智伟,等.丹皮酚抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的实验研究[J].浙江医学,2014,36(18):1524-1526.

[6]Tentillier N,Etzerod tA,Olesen M N,etal.Anti-inflamm atorym odulation of m icrog lia via CD163-targeted g lucocorticoids p rotects dopam inergic neurons in the 6-OHDA Parkinson's d isease model[J].JNeurosci,2016,36(36):9375-9390.

[7]Nayak D,Roth T L,McGavern D B.Microg lia Development and Func tion[J].Annu Rev Immunol,2014,32:367-402.

[8]Benarroch EE.Microg lia:Multip le roles in surveillance,circuitshaping,and response to injury[J].Neurology,2013,81(12):1079-1088.

[9]Ransohoff R M.How neuroinflamm ation contributes to neurodegeneration[J].Science,2016,353(6301):777-783.

[10]Fan Z,Aman Y,Ahm ed I,eta l.Influence o fm icrog lia lactivation on neuronal function in Alzheimer's and Parkinson's d isease dem entia[J].Alzheimers Dement,2015,11(6):608-621.

[11]Borra jo A,Rod riguez-Perez A I,Villar-Cheda B,et al.Inhibition of the m icrog lial response is essential for the neurop rotective effects of Rho-kinase inhibitors on MPTP-induced dopam inergic celldeath[J].Neuropharmacology,2014,85:1-8.

[12]Bournival J,Plouffe M,Renaud J,et al.Quercetin and sesam in p rotect dopa-m inergic cells from MPP+-induced neuroinflamm ation in a m icrog lial(N9)-neuronal(PC12)coculture system [J].Oxid Med Ce ll Longev,2012:921-941.

[13]Marinova-Mutafchieva L,Sadeghian M,Broom L,et al.Relationship between m icrog lial activation and dopam inerg ic neuronal loss in the substantia nig ra:a tim e course study in a 6-hyd roxydopam inem odelof Parkinson's d isease[J].JNeurochem,2009,110(3):966-975.

[14]Emm rich J V,Hornik T C,Neher J J,et al.Rotenone induces neuronaldeath bym icrog lialphagocytosis o f neurons[J].Febs J,2013,280(20):5030-5038.

[15]Zhao Y,Fu B,Zhang X,et al.Paeono lp retreatm ent attenuates cereb ral ischem ic injury via up regulating exp ression of pAkt, Nrf2,HO-1 and ameliorating BBB permeability inm ice[J].Brain Res Bull,2014,109:61-67.

[16]Zhou J,Zhou L,Hou D,eta l.Paeonol increases levels o f cortical cytochrom e oxidase and vascu lar ac tin and im p roves behavior in a rat mode l of Alzheim er's d isease [J].Brain Res, 2011,1388:141-147.

[17]Tao W,Wang H,Su Q,et al.Paeonol attenuates lipopolysaccharide-induced dep ressive-like behavior in m ice[J].Psychiatry Res,2016,238:116-121.

[18]王浩,耿赵铭,呙登俊,等.丹皮酚对血管性认知障碍小鼠认知功能的保护作用[J].温州医科大学学报,2014,44(10):708-711.

[19]He L X,Tong X,Zeng J,et al.Paeonol supp resses neuroinflammatory responses in LPS-activated m icrog lia cells[J].Inflammation,2016,39(6):1904-1917.

Paeonol pretreatment inhibits MPP+induced BV2 microglia activation in Parkinson disease

WANG Hao,ZHANG Zhenzhong,LI

Zhongchun,et al.Department of Neurology,Tongde Hospital of Zhejiang Pronince,Hangzhou 310012,China

Objective To investigate the effects of paeonol on MPP+induced BV2 m icrog lia activation,which is a cell model of Parkinson d isease. Methods After MPP+and paeonol p retreatment,cell viability was detected by CCK-8 assay; m icrog lial phagocytosis was assessed by immunostaining methods,and inflammatory cytokine release was determ ined according to the ELISA kits. Results MPP+treatment(0.1μmol/L)significantly enhanced BV2 m icrog lial cell viability,increased m icrog lial phagocytosis,and enhanced inflammatory cytokine of TNF-α,IL-1β,IL-6 release.Com pared to the MPP+g roup, Paeonol treatment(5,25μmol/L)significantly inhibited the increase of cell viability,dec reased m icrog lial phagocytosis,and reduced TNF-α,IL-1β,IL-6 release. Conclusion Paeonol can p revent MPP+induced BV2 m ic rog lia activation,and the mechanism may be related to inhibitm ic rog lialphagocytosis,and the anti-inflammatory effects.

Paeonol Parkinson d isease Microg lia Inflammatory cytokine

2016-11-04）

（本文编辑：陈丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-1815

国家自然科学基金项目（81401566）；浙江省自然科学基金（LQ 15H 090005）；浙江省医药卫生科技项目（2015KYB076）；浙江省中医药管理局科研基金项目（2015ZB012）

310012杭州，浙江省立同德医院神经内科（王浩、张震中、李中春）；浙江大学医学院附属第一医院麻醉科（赵冰）

赵冰，E-mail：zhaobingzju@163.com