添加动物源氨基酸水解液研制生物有机肥

李 静, 李 荣, 沈其荣, 俞 萍, 余光辉*

1.南京农业大学资源与环境科学学院, 江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室, 农业部长江中下游植物营养与施肥重点实验室, 江苏 南京 210095 2.南京秦邦吉品农业开发有限公司, 江苏 南京 211516

添加动物源氨基酸水解液研制生物有机肥

李 静1, 李 荣1, 沈其荣1, 俞 萍2, 余光辉1*

1.南京农业大学资源与环境科学学院, 江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室, 农业部长江中下游植物营养与施肥重点实验室, 江苏 南京 210095 2.南京秦邦吉品农业开发有限公司, 江苏 南京 211516

为改善生物有机肥性质，提高生物有机肥质量，采取在生物有机肥中添加外源氨基酸水解液以提升生物有机肥中功能微生物的数量. 以病死猪酸解制得氨基酸水解液为生物有机肥外加原料，研究了氨基酸水解液添加量、有机肥种类(鸡粪、牛粪、中药渣)、发酵时间对功能菌株SQR9数量的影响. 结果表明：当氨基酸水解液添加量为20%时固体发酵效果优于其他接种量，预发酵3 d后接种SQR9的功能菌数量明显高于未预发酵直接接菌，预发酵中肥料(以干质量计，下同)的最高功能菌数量可达4×108CFUg，而第0天接菌时肥料的最高功能菌数量仅为1.2×108CFUg. 以腐熟鸡粪、牛粪、中药渣堆肥为载体，添加酸解氨基酸研制生物有机肥的最优接菌量分别为10.0%、7.5%、10.0%；SQR9菌株生长的最佳含水量为40%. 此外，氨基酸水解液的添加可提高生物有机肥的w(TN). 研究显示，氨基酸水解液的添加能有效促进固态发酵过程中功能菌株数量的增加.

病死动物; 氨基酸液; 生物有机肥; 功能菌; 固体废物

生物有机肥一般是由腐熟堆肥(腐熟鸡粪、腐熟牛粪、腐熟中药渣等)、蛋白源(羽毛粉、菜粕、蓝藻泥等)和功能微生物(固氮微生物、解磷微生物、根际促生微生物等)组成，同时具备微生物肥料和有机肥料双重效果[1]. 该类有机肥具有改善土壤理化性质和微生态环境[2]、提高土壤肥力[3]、增强作物抗逆性、减少或代替部分化肥和农药[4-5]、降低农产品中的有害物质[6]及改善作物品质等优点，是微生物技术应用在有机肥料中的一次创新.

随着我国经济的快速发展，人均生活水平得到不断提高，畜禽养殖行业也得到了迅猛的发展. 通常将大规模集约化畜禽养殖产生的大量病死动物称为动物残体. 动物残体可能携带大量对人体有害的病原菌，所以给人类的生命安全带来巨大的威胁. 动物残体对环境中土壤和水体也存在很大的危害[7]，如2013年上海黄浦江漂浮6 000多头死猪的重大事件，严重污染了黄浦江水质. 在过去，动物残体一般被转化为动物饲料产品蛋白添加剂“Meat and bone meal”. 但是后来这种产品被发现能够导致牛海绵状脑病、猪瘟疫等一些动物疾病[8]，因此，动物残体作为动物饲料蛋白添加剂在欧洲是被禁止的. 那么，如何有效地处理动物残体已然成为众多研究者的焦点课题[9]. 填埋法[10]是将动物残体埋入特定规划的土壤中，通过土壤微生物的分解作用缓慢地降解动物残体. 该方法的优点是操作简单、成本低廉，缺点是会对土壤资源造成极大浪费，并且可能对土壤造成污染. 焚烧法[11]是利用高温将动物残体彻底焚烧至灰分，该方法的优点是对病原菌进行了彻底的杀灭，处理时间短；缺点是焚烧耗能产生大量的PM2.5会带来一定的大气污染，消耗巨大的能源，并且动物残体作为一种高蛋白资源也是极大的浪费. 堆肥法[12]，是将动物残体与一些秸秆物质进行混合，在封闭的环境中进行发酵处理. 该方法的优点是对动物残体作为高蛋白资源进行了合理的利用，缺点是发酵温度低，有可能无法对动物残体携带的大量病原菌进行彻底杀灭，并且处理时间较长. 江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室联合江阴市联业生物科技有限公司，利用酸解工艺，以病死猪为主要原料，研制出氨基酸水解液，该工艺采用硫酸在密闭的环境中将病死猪转化为氨基酸工艺原理，无二次污染，但新工艺产生的大量氨基酸亟待资源化利用. 目前，研究者大多采用菜粕等植物来源的氨基酸作为原料制备生物有机肥，而利用动物源氨基酸研制生物有机肥的研究还鲜见报道；同时，由于菜粕等植物来源的氨基酸成本持续升高，严重制约了生物有机肥产业的发展. 由于动物源氨基酸同时具有碳活性较高以及氮素有效性高的特征[13]，因此，利用病死猪酸解制得氨基酸水解液为外源蛋白添加剂研制生物有机肥，预计能够有效资源化酸解氨基酸液和促进生物有机肥产业的发展.

该研究利用江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室已筛选到的具有促生以及生物防治功能的植物根际促生细菌(PGPR)菌株——BacillusamyloliquefaciensSQR9[14-15]为目标菌株，研究了病死猪氨基酸水解液添加量、有机肥种类(鸡粪、牛粪、中药渣)、接种菌种发酵时间对功能菌株SQR9数量的影响，以期为新型PGPR菌株产品的开发提供理论与技术支持.

1 材料与方法

1.1 供试材料与培养基、种子悬液

固态发酵原料：腐熟鸡粪、腐熟牛粪、腐熟中药渣，由江苏省江阴市联业生物科技有限公司提供. 这三种原料的基本理化性质如表1所示.

表1 固态发酵原料的基本理化性质

注：表中数据为平均值±标准偏差.

供试功能微生物——解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensSQR9[16]：由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室筛选保存. SQR9具有广谱促生、抗病等效果，并且对NaCl有很高的耐受性，能产生耐热、抗逆的芽孢，有利于在恶劣的环境中生长与繁殖，故而选用该菌株作为生物肥料的功能菌株.

功能菌SQR9种子悬液的制备：采用液体LB培养基，在30 ℃、170 r/min下培养12 h，按照5%的量接入液体LB培养基中，相同条件下摇床培养36 h.

功能菌SQR9选择性培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂2.5%，去离子水1 000 mL，pH为7.2～7.4，121 ℃下高压灭菌20 min. 1%多黏菌素2 mL/L，1%放线菌酮4 mL/L[17].

功能菌SQR9计数：称取5 g肥料于50 mL的无菌水中，170 r/min下振荡20 min，稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同梯度稀释液. 用无菌吸管各取0.1 mL涂布于选择性培养基平板中，不同梯度各3个平板，30 ℃培养箱中培养36 h后计数. 最终功能菌的数量以每g肥料干质量计算，表示为CFU/g肥料.

氨基酸水解液由实验室研制，主要通过酸解病死猪制得，养分含量：w(TN)为12.2 g/L，w(TP)为0.77 g/L，w(TK)为1.67 g/L.

1.2 生物有机肥固态发酵方案设计

在腐熟鸡粪、牛粪、中药渣堆肥中添加不同氨基酸水解液添加量(5%、10%、20%、30%)，分别在不同时间点接菌(发酵0 d、发酵3 d)进行固态发酵，确定氨基酸水解液的最适添加量以及接菌的最优时间点. 各处理做3个重复，每个重复肥料的总质量为300 g(以干质量计，下同). 所有处理设置相同的初始接菌量5%(V/m)，发酵温度为室温〔(30±2)℃〕，肥料发酵6 d，每隔12 h翻一次堆，分别与0、2、4和6 d时取样计数功能菌数量.

在腐熟鸡粪、牛粪、中药渣堆肥中，发酵第3天接菌，分别为5.0%、7.5%、10.0%、12.5%(V/m)进行固态发酵，以确定最优接菌量. 所有处理设置相同氨基酸水解液浓度20%(V/m)，其他发酵条件同上.

1.3 测定方法

理化性质检测：含水量检测参见文献[18]，称取试样20 g，在105 ℃下干燥至恒质量.

w(TC)、w(TN)采用元素分析仪检测，pH采用pH计方法[19]检测，w(TP)、w(TK)参照NY 525—2012《有机肥料标准》测定.

1.4 数据分析

采用Excel 2013、SigmaPlot 13.0和SPSS 20.0软件进行数据统计分析，使用最小显著差异法(Least significant difference，LSD)检验进行多重比较(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 氨基酸水解液最适添加量以及接菌最优时间点

研究了不同有机肥与氨基酸水解液发酵对PGPR菌株SQR9发酵菌数量的影响，结果见图1、图2. 图1、表2表明，发酵3 d接菌的数量显著高于发酵0 d接菌. 堆肥结束后，发酵3 d接菌肥料(干质量)的最高功能菌数量可达到4.0×108CFU/g，而发酵0 d接菌肥料的最高功能菌数量仅为1.2×108CFU/g.

不同有机肥与不同氨基酸水解液添加量(5%、10%、20%、30%)发酵的研究结果见图2. 图2表明，随着氨基酸水解液添加量的增加，功能菌SQR9的数量逐渐增加，当氨基酸水解液添加量达到20%时肥料中SQR9功能菌数量也达到最高，为4.0×108CFU/g.

氨基酸水解液添加量/%： 1—5； 2—10； 3—20； 4—30.图1 预发酵3 d后接菌对菌株SQR9数量的影响Fig.1 Effect of three days pre-compost before solid-state fermentation on the number of strain SQR9

氨基酸水解液添加量/%： 1—5； 2—10； 3—20； 4—30.图2 无预发酵直接接菌对菌株SQR9数量的影响Fig.2 Effect of solid-state fermentation without pre-compost on the number of strain SQR9

从节约成本的角度考虑，该研究选择20%的氨基酸水解液添加量作为后续试验的参考.

2.2 最优接种量及pH和含水量的变化

研究添加不同初始接菌量的腐熟鸡粪、牛粪、中药渣对菌株固态发酵效率的影响，结果见图3. 图3表明，随着接菌量的提高，功能菌SQR9的菌落数量逐渐提高. 对于腐熟鸡粪堆肥，当接菌量大于7.5%时，如10.0%与12.5%，对肥料中的功能菌数量无显著差异；对于腐熟牛粪堆肥，当接菌量为7.5%～10.0%时，肥料中的功能菌数明显下降；对于腐熟中药渣堆肥，当接菌量大于10.0%时，肥料中的功能菌数量明显下降，从生产成本考虑，后续腐熟鸡粪、中药渣堆肥试验的初始接菌量分别为10.0%、7.5%、10.0%. 腐熟的鸡粪堆肥过程中肥料的pH在发酵过程中变幅较小，一直保持在6.00左右，腐熟牛粪、中药渣堆肥过程中肥料的pH在发酵过程中变幅较大，pH最低为5.78，最高为7.44. 三种腐熟堆肥的含水量均保持在40%左右(见图4).

接菌量/%： 1—5.0； 2—7.5； 3—10.0； 4—12.5.图3 不同接菌量对固体发酵过程中菌株SQR9数量变化影响Fig.3 Effects of different inoculation amounts on the variations of strain SQR9 number during solid-state fermentation

接菌量/%： 1—5.0； 2—7.5； 3—10.0； 4—12.5.图4 鸡粪有机肥、牛粪有机肥、中药渣有机肥添加氨基酸预发酵3d接种SQR9菌株发酵过程中pH和含水量的变化Fig.4 Variations of pH and water contents during solid-state fermentation with inoculation of SQR9 in the mixture of chicken manure compost, cow manure compost, Chinese traditional medicine residues compost and amino acids after 3 days pre-compost

2.3 生物有机肥的基本理化特性

比较表1、2可知，三种生物有机肥中w(TC)、w(TN)、w(TP)、w(TK)均无显著性差异， 但添加氨基酸水解液的肥料处理中w(TN)较高，这与氨基酸本身氮含量较高有关，同时外源氨基酸的添加增加了肥料中的养分、游离氨基酸和短肽的含量. 因此，氨基酸水解液作为生物有机肥料的添加原料，不仅对生物有机肥中功能微生物有促进繁殖的作用，还可提高生物有机肥的质量,此外，还能提高生物有机肥中总氮的含量.

表2 以鸡粪、牛粪、中药渣为原料腐熟生物有机肥的基本理化性质

3 讨论

试验结果表明，在利用腐熟堆肥制备生物有机肥过程中，不添加氨基酸水解液或不经过预发酵，功能微生物在堆肥中的数量不升反降，这可能是由于普通有机肥中缺乏外源营养的添加，限制了功能菌的繁殖[20]. 同时，在添加外源氨基酸时，由于外源氨基酸是由硫酸酸解病死猪制得的，含有过多的硫酸，导致堆体pH过低，从而限制了功能菌的繁殖[21]. 氨基酸水解液与不同有机肥预发酵3 d后，接种菌株SQR9研制生物有机肥，氨基酸水解液能有效促进SQR9菌数的生长. 这是由于预发酵后pH回升，外源氨基酸资源的添加对生物有机肥中功能微生物有促进繁殖的作用，这与Kinnersley等[22]的研究结果一致. 同样，曹亮亮等[23]以膨化羽毛粉和菜粕为生物有机肥添加原料，有效地提高了生物有机肥中功能微生物的数量. 张苗等[24]添加三种外源蛋白质，提升了生物有机肥中功能微生物的数量. 基于以上试验结果，该研究以酸解病死猪制成的氨基酸水解液，也同样有效地提高了SQR9的菌数. 但该试验利用酸解病死猪研制的氨基酸水解液作为外源蛋白添加剂，既节约成本，又变废为宝，同时也满足了生物有机肥对蛋白资源的需求.

氨基酸的添加同时能提高生物有机肥中的w(TN)，在腐熟堆肥中添加藻泥、豆饼等蛋白资源能显著改变堆肥的理化性质[25]，还能提高堆肥的pH和堆肥中氨基酸的含量. 生物有机肥中游离氨基酸可以直接被作物吸收从而作为植物的养分[26]，对植物的生长有重要意义[27]，还能有效促进作物生长[28-29]. 另外，氨基酸含有羧基(—COO)和氨基(—NH2)两个官能团，可以螯合土壤金属离子，促进植物对一些微量元素的吸收[30]. 因此，可推测该研究研制的生物有机肥具有潜在的应用价值. 另外，从生产成本考虑，20%为氨基酸水解液的最适添加量，鸡粉、牛粪、中药渣最优的接菌量分别为10.0%、7.5%、10.0%，其含水量保持在40%最适宜SQR9菌株的生长. 发酵3 d接菌，SQR9的数量显著高于发酵0 d接菌.

4 结论

a) 采用病死猪酸解制得的氨基酸水解液为生物有机肥外加原料，发酵3 d接菌的SQR9菌数显著高于发酵0 d接菌. 发酵3 d接菌时肥料的最高功能菌数量可达4×108CFU/g，而发酵0 d接菌时肥料的最高功能菌数量仅为1.2×108CFU/g.

b) 后续腐熟鸡粪、牛粪、中药渣堆肥试验的最优接菌量分别为10.0%、7.5%、10.0%，氨基酸水解液的最适添加量为20%. 此外，SQR9菌株生长的最佳含水量为40%.

c) 氨基酸资源不仅对生物有机肥中功能微生物有促进繁殖的作用，同时能提高生物有机肥中的w(TN).

d) 氨基酸水解液的添加能有效促进功能菌株的固态发酵，该研究结果可为该类固体废物的资源化利用提供理论依据.

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Development of Bio-Organic Fertilizer by Adding Amino Acids Hydrolyzed from Animal Carcasses

LI Jing1, LI Rong1, SHEN Qirong1, YU Ping2, YU Guanghui1*

1.College of Resources and Environmental Sciences, Jiangsu Key Laboratory of Solid Organic Waste Utilization, Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China 2.NanjingQinbang Jipin Agricultural Development Co. Ltd., Nanjing 211516, China

In order to improve the quality of bio-organic fertilizer, exogenous amino acids hydrolyzed from animal carcasses were utilized as additives into matured composts to create novel bio-organic fertilizers (BIOs) containing plant growth-promoting rhizobacteria SQR9. The effects of adding amounts of exogenous amino acids, types of organic manures (e.g, chicken manure, cow manure and Chinese medicine residue) and fermentation time on the number of inoculants, strain SQR9, were investigated. The results showed that addition of 20% amino acids resulted in more effective solid-state fermentation efficiency than other treatments. Inoculating strain SQR9 after pre-composting for three days showed obviously higher amounts of the functional microbes, with the highest number of 4×108CFU/g fertilizer in dry weight than those treatments without pre-composting (adding amino acids and inoculating bacteria meanwhile) with the highest number of 1.2×108CFU/g fertilizer in dry weight. The optimal inoculation amounts of strain SQR9 in chicken manure, cow dung and Chinese medicine residue composts were 10.0%, 7.5% and 10.0%, respectively, with optimal water content maintaining at around 40%. Moreover, the addition of amino acids increased the total N amount in all treatments. In conclusion, the addition of amino acids hydrolyzed from animal carcasses could effectively promote the growth of functional bacterial strains during solid-state fermentation.

dead animal; amino acids; bio-organic fertilizer; functional microbes; solid waste

2016-09-06

2017-03-14

中央高校基本科研业务费专项(KYCYL201502)；国家重点研发计划项目(2016YFD0800605，2016YFD0200106)

李静(1990-)，女，山西忻州人，2015803170@njau.edu.cn.

*责任作者，余光辉(1978-)，男，河南商丘人，教授，博士，博导，主要从事固体废物资源化利用和土壤肥力提升研究，yuguanghui@njau.edu.cn

X705

1001- 6929(2017)06- 0967- 07

A

10.13198/j.issn.1001- 6929.2017.02.26

李静,李荣,沈其荣,等.添加动物源氨基酸水解液研制生物有机肥[J].环境科学研究,2017,30(6):967- 973.

LI Jing,LI Rong,SHEN Qirong,etal.Development of bio-organic fertilizer by adding amino acids hydrolyzed from animal carcasses[J].Research of Environmental Sciences,2017,30(6):967- 973.