甘薯祖先种三浅裂野牵牛自交不亲和研究进展

2017-06-13戴习彬周志林赵冬兰曹清河

江西农业学报 2017年5期

张安，戴习彬，周志林，赵冬兰，唐君，曹清河*

(1.农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室，江苏徐州 221131；2.中国农业科学院甘薯研究所，江苏徐州 221131；3.江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏徐州 221131)

张安1,2,3，戴习彬1,2,3，周志林1,2,3，赵冬兰1,2,3，唐君1,2,3，曹清河1,2,3*

二倍体三浅裂野牵牛(Ipomoeatrifida)是六倍体栽培种甘薯的祖先种之一。这种植物具有孢子体自交不亲和性(Sporophytic Self-incompatibility，SSI)，由单位点复等位基因决定，即S位点。综述了三浅裂野牵牛自交不亲和性的研究进展，从SSI表现形式、已排除候选基因、S位点的分离与结构、候选S基因分析几个方面进行了论述，并在此基础上对三浅裂野牵牛自交不亲和的独特性进行了归纳。

三浅裂野牵牛；自交不亲和；甘薯

自交不亲和(Self-incompatibility,SI)是被子植物阻止自交、促进杂交的遗传学机制[1]。在自交不亲和的植物中，当花粉被识别是自身后，一些阶段比如花粉萌发、花粉管伸长，子房受精，或者胚发育就会受到抑制，也就不会产生种子。根据花型，SI可分为同型(Homomorphic)SI和异型(Heteromorphic)SI。同型SI又可根据花粉决定因子表达差异分为孢子体自交不亲和(Sporophytic Self-incompatibility，SSI)和配子体自交不亲和(Gametophytic Self-incompatibility,GSI)。

很多植物是SSI，比如十字花科、菊科、锦葵科、桦木科、梧桐科、花葱科、旋花科[2]。在这些植物中，SSI是由单位点复等位基因调控，即S位点。S位点内有2组紧密连锁的基因(S基因)，一组编码雄性决定因子，另一组编码雌性决定因子。这2组基因产物决定了自我/非我识别，并作为一个单元稳定遗传而维持SI[3]。在SSI系统中，自身花粉不能萌发或者不能穿透柱头细胞，因此自我/非我识别就发生在柱头表面。

三浅裂野牵牛(Ipomoeatrifida)是旋花科甘薯属栽培种甘薯的祖先种之一[4]。甘薯属植物表现出强烈的SSI，而且有别于其他植物SSI。本文对三浅裂野牵牛独特的SSI研究进行了汇总，从SSI表现形式、已排除候选基因、S位点分离与结构、候选S基因分析几个方面进行论述，希望为今后的研究提供参考。

1 三浅裂野牵牛SSI的表现形式

杂交亲和的花粉在授粉10～20 min后就会萌发[5]，但在自交不亲和的时候，花粉萌发就会受到抑制，不能形成种子。三浅裂野牵牛的SI系统中雄、雌决定因子的自我识别发生在授粉之后。表型分离显示三浅裂野牵牛受单位点复等位基因的S位点控制[5-6]，SI的花粉表现出明显的孢子体显隐关系，这些特点与SSI一致。芸薹属植物使用二氧化碳处理和花蕾期授粉的方法可以克服自交不亲和[7]，但是这些方法不适用于三浅裂野牵牛。由此可知，三浅裂野牵牛的SSI机制要强于芸薹属植物。

Kowyama等[6]从中美洲收集的6个自然群体、224个单株中确认了49个S位点。三浅裂野牵牛不同S位点表现为线性显隐关系，分为5种类型(图1)。除了少数例外，每个类型的S等位基因在雄、雌反应中都是相同的。比如，S22和S29在雌性反应中是共显性，雄性反应中S22对S29是显性。Kakeda等[8]获得一个自发突变的自交亲和性突变体MX1，命名为Sc。MX1和其他S纯合体杂交后代F1的遗传分析表明Sc等位基因也包括在显隐关系中，Sc相对S1是隐性，相对S10是显性。

图1 不同类型S位点之间的显隐关系

2 已被排除的候选S基因

S基因必须符合以下几种条件：雄性和雌性S基因分别在绒毡层和乳突细胞内表达，在S位点内紧密连锁，每个基因组内必须是单拷贝，并具有多样性。在早期研究中，已将三浅裂野牵牛生殖相关特异基因以及其他植物同源S基因分离出来。Ipomoea的柱头蛋白(Ipomoeastigma protein 11,ISP11)从成熟柱头cDNA文库中分离，已确定这个基因不是S基因，因为它在柱头和花药中都表达，与S位点不连锁，尽管它是一个单拷贝基因[9]。柱头相关激酶(Stigma related kinase,SRK)是芸薹属雌性S基因[10-11]，S位点糖蛋白(S-locus glycoprotein,SLG)是S相关基因[12]。由于三浅裂野牵牛具有和芸薹属相似的SI系统，SLG或SRK同源蛋白可能存在于三浅裂野牵牛生殖器官内。从柱头cDNA文库中分离出甘薯分泌糖蛋白基因(Ipomoeasecreted glycoprotein,ISG1,-2,-3)，表现出与SLG序列相似性。但是这些基因也不与S位点连锁，被认为是在多种组织表达的细胞膜蛋白激酶[13-14]，与甘蓝的SLR3相似[15]。甘薯受体激酶基因(Ipomoeareceptor kinase 1,IRK1)作为SRK的同源基因被分离出来，氨基酸序列与芸薹属SRK6[16]、拟南芥ARK1[17]更相似，与玉米ZmpK1较远[18]。但是基因表达模式和RFLP分析表明，IRK1与三浅裂野牵牛的SI没有关系[19]。

烟草S位点核酶(S-RNase)[20]被认为是雌蕊蛋白。S-RNase在雌蕊中大量表达，可以从组织提取物中使用蛋白质电泳检测到。从三浅裂野牵牛柱头提取蛋白进行双向电泳，只检测到一个蛋白[21]，这个蛋白大约70 kDa，等电点(PI)为4～6，与S位点关联，所以命名为S位点连锁柱头蛋白(S-locus linked stigma proteins,SSPs)。SSP编码短链乙醇脱氢酶，在柱头成熟乳突细胞内大量表达。但是，多种类型S位点SSP氨基酸序列表现出95%以上的一致性，所以这个基因也不是S基因[22]。

3 三浅裂野牵牛S位点的分离和结构

使用分子标记手段确定了三浅裂野牵牛S位点。从4种S位点(S1S22×S10S29)F1中选取10～15株植物，基于AFLP(amplified fragment length polymorphism)和AFM(AFLP-based mRNA fingerprinting)分析，获得8个S位点连锁标记，3个定位于S位点附近(SAM-23,AAM-68,AF-41)[22]。SAM-23标记来自柱头AMF分析，包含部分SSP基因序列。AAM-68标记来自花药AMF分析，与S位点关联。AAM-68标记是糖基转移酶的部分序列，在花药和花粉中表达，但是不同类型S位点的氨基酸序列表现出高度相似性。这个发现说明AAM-68不太像是S基因。AFLP显示AF-41标记位于S位点另一端，距SAM-23 0.11 cM，其序列与拟南芥组氨酸去乙酰化酶有些相似。

目前，还没有在任何植物内发现SI雄雌决定基因重组，如果发生重组将会破坏SI[23]。在873个三浅裂野牵牛后代中没有发现重组，所以S位点可能位于一个重组抑制区。分析873个后代分子标记附近的DNA序列定位了4个重组位点，据此，将三浅裂野牵牛的S位点限制在0.23～0.57 cM范围内，物理大小约212 kb[24]。

染色体重组率使用单位DNA内重组单元长度来表示(kb/cM)，数值越高说明越不易发生重组。在油菜中，S8单体型的S位点长约70 kb，包含2个相距0.3 cM的重组位点，重组率为233 kb/cM[23]。三浅裂野牵牛S1单体型S位点的重组率是920 kb/cM[24]，比油菜的高，所以三浅裂野牵牛S位点内重组被高度抑制。矮牵牛S位点处于着丝粒区域内，重组率高达17.6 Mb/cM[25]。荧光原位杂交表明，三浅裂野牵牛S位点位于染色体长臂末端附近[26]。这个结果支持三浅裂野牵牛的S位点重组抑制不是由位置引起的，S位点重组抑制可能是被调控的。

芸薹属S位点表现出多态性。为确定三浅裂野牵牛S位点多态性区域，分别构建S1[27]和S10[24]纯合体文库，通过比较S1和S10的S位点区域发现了多态区域，命名为S单体型特异多态区(S-haplotype specific divergent region,SDR)。S10的SDR长约50 kb，S1的SDR长约35 kb。SDR附近区域在不同类型之间比较保守。在其他SI植物如芸薹属中，也发现高度多态区，长约30～56 kb，SDR附近区域也很保守[28]。在李属和苹果属中也发现这种多态区域[29-30]。在这些植物中，SI的雄、雌决定基因位于多态区域内。因此，三浅裂野牵牛的S决定基因可能也位于SDR区域内。

不同类型三浅裂野牵牛的SDR大小差异可能是转座子、反转座子、简单序列重复插入、积累引起的[24]。通过比较S位点还发现等位基因显性和SDR大小之间的关联：SDR越长则显性越强。

4 三浅裂野牵牛S位点内的基因

为了确定三浅裂野牵牛S位点内的基因，测定了S1类型S位点全序列。发现10多个基因，包括3个柱头特异基因(SE1,SE2,SEA)，4个花药特异基因(AB1,AB2,AB3,AB4 )[31](图2)。3个柱头基因和3个花药基因(AB1,AB2,AB3)位于的SDR区。对繁殖器官多个发育阶段和营养器官总RNA进行Northern杂交分析表明，所有花药基因在开花前1～2周的花药内表达，所有柱头基因从开花前1周至开花前1 d都有表达。这6个基因在其他繁殖器官或营养器官内没有检测到。Southern杂交表明，AB1至少有2个拷贝，但是其他5个都是单拷贝。根据S基因特征，5个基因(AB2,AB3,SE1,SE2,SEA)是候选S基因。

花药基因中，S1-AB1与S1-AB3相似性达95%，但是AB1不在S10的SDR内。而且，不同类型S位点的AB1与AB3的相似性都高达95%，由此推测，AB1和AB3不太可能是S位点雄性决定基因。另一方面，AB2位于所有检测的S位点内，这些基因的氨基酸序列表现出46%～58%的一致性。从时空表达分析来看，AB2只在开花前7～14 d的花药绒毡层内表达，不在其他繁殖器官和营养器官内表达。

此外，AB2蛋白序列表现出和植物防御素具有同源性。防御素是小抗菌肽(少于100个氨基酸)，富含半胱氨酸(Cys)，属于gamma-thionin蛋白家族，广泛存在于动植物内[32]。类防御素蛋白基因比如PCP-A1和SP11/SCR在芸薹属绒毡层内表达[33-34]。三浅裂野牵牛的AB2和芸薹属SP11/SCR氨基酸对比表明，只有8个Cys残基比较保守，保守Cys之间的序列长度和残基都不保守。如果AB2蛋白是三浅裂野牵牛S雄性决定因子，它可能是配体。

柱头特异基因也表现出多态性，不同类型S位点的SE1、SE2、SEA氨基酸序列之间的相似性分别是53%～76%、67%～69%、52%～62%。基因表达分析表明，SE1、SE2和SEA在开花前1～7 d的乳突细胞内表达。亲水性图表明这些蛋白可能都具有3～4个跨膜结构域，可能位于乳突细胞膜内。柱头特异蛋白结构与罂粟科PrpS蛋白[35]和花蛋白[36]这些雄性决定因子相似，可能作为乳突细胞膜内吞钙离子通道。罂粟GSI中，花粉管钙离子增加可能受到PrpS的调控。如果柱头特异蛋白在三浅裂野牵牛中有相似的功能，那么可能通过钙离子诱导信号传递途径来抑制自身花粉萌发。

总体来说，目前的数据表明在柱头乳突细胞内表达的SE1、SE2、SEA可能是S雌性决定基因，在花药绒毡层内表达的AB2很可能是S雄性决定基因。为获得更确定的证据，需要对这些基因的转基因功能和分子相互作用进行验证。

5 展望

被子植物的SI是复杂的遗传机制。车前草科、茄科、蔷薇科的GSI系统中S-RNase是雌性决定因子，SFB/SLF和相关蛋白是雄性决定因子，雌性因子进入花粉管诱导RNA和蛋白质降解[37]。在另一种GSI中，罂粟PrpS蛋白作为柱头中的配体，PrpS作为花粉管上的受体和离子通道，它们之间的作用诱导钙离子介导的信号级联反应，导致细胞凋亡来阻止花粉管生长[35,38-39]。另一方面，十字花科SSI中的SRK作为乳头细胞受体激酶，SP11/SCR作为花粉中的配体，两者相互作用，通过下游信号分子的磷酸化途径抑制自身花粉管萌发[40]。从目前来看，三浅裂野牵牛不是上述任何信号通路[41]。

图2 S1和S10 的SDR区内基因结构对比

有趣的是，三浅裂野牵牛的SI系统中，AB2与芸薹属SP11/SCR相似，可能是雄性决定因子，但是，雌性决定因子SE1、SE2、SEA和罂粟雄性决定因子PrpS相似，说明了三浅裂野牵牛SI的独特性。这个发现支持被子植物进化过程中SI独立起源假说[42]。这些研究可能对SI系统进化提供重要信息，同时也有助于包括甘薯在内的旋花科植物育种。

基因组测序为我们提供了最为丰富的基因信息，为基因组范围内搜索同源序列提供方便。目前，自交不亲和的三浅裂野牵牛和自交亲和的牵牛花(Ipomoeanil)基因组已测序完毕[43-44]，通过比较两者的SI同源基因，有可能给出甘薯属自交不亲和机理的最终答案。

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(责任编辑：曾小军)

Research Advance in Self-incompatibility ofIpomoeatrifida, An Ancestor of Sweet Potato

ZHANG An1,2,3, DAI Xi-bin1,2,3, ZHOU Zhi-lin1,2,3,ZHAO Dong-lan1,2,3, TANG Jun1,2,3, CAO Qing-he1,2,3*

(1. Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding of Sweet Potato, Ministry of Agriculture, Xuzhou 221131, China; 2. Institute of Sweet Potato, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xuzhou 221131, China; 3. Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area of Jiangsu, Xuzhou 221131, China)

DiploidIpomoeatrifidais an ancestor of the cultivated hexaploid sweet potato (Ipomoeabatatas). This plant has sporophytic self-incompatibility (SSI), which is controlled by a single multiallelic locus (S-locus). This paper summarized the research progress in the self-incompatibility ofI.trifida, including the pattern of SSI performance, the excluded candidate genes, the isolation and structure ofS-locus, and the analysis ofScandidate gene, and summed up the peculiarity of self-incompatibility ofI.trifida.

Ipomoeatrifida; Self-incompatibility; Sweet potato

2017-01-04

江苏省徐州市国际合作项目(KC16H0227)；国家自然科学基金国际合作项目(3141101083)；国家甘薯产业技术体系 (CARS-11-B-02-2016)。

张安(1984─)，男，山东菏泽人，助理研究员，博士，主要从事甘薯生物技术研究。*通讯作者：曹清河。

S531

1001-8581(2017)05-0017-05