BMPR—IB基因多态性与湖羊产羔性能的关系

杨媛 翁恺麒 李拥军 顾祝荣 郭海燕

摘要[目的]研究骨形态发生蛋白受体IB（Bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）基因多态性与湖羊产羔性能的关系。[方法]采用PCR扩增、酶切和序列测定等方法对湖羊BMPR-IB基因型进行鉴定，并分析BMPR-IB基因型与湖羊产羔数的关系。[结果]共检测出3种基因型，并将其分别定义为AA、AG、GG。测序结果表明，等位基因A与G相比发生了1处碱基突变（A746G）。BMPR-IB基因在湖羊中存在多态性（AA、AG和GG）；湖羊中A等位基因的频率为0.032，G等位基因的频率为0.968。AA、AG和GG基因型频率分别为0.006、0.053和0.941。AA、AG和GG基因型湖羊的平均产羔数分别为1.25、1.81和1.96。[结论]BMPR-IB基因可能是湖羊多胎性能的主效基因，可用于对湖羊产羔数的选择。

关键词湖羊；BMPR-IB基因；产羔数

中图分类号S826文献标识码A文章编号0517-6611（2017）26-0113-03

Relationship between Polymorphism of BMPRIB Gene and Lambing Performance of Hu Sheep

YANG Yuan， WENG Kaiqi， LI Yongjun* et al

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University/Key Laboratory for Animal Genetic， Breeding， Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract[Objective]To study the relationship between the polymorphism of bone morphogenetic protein receptor IB（BMPRIB） gene and the lambing performance of Hu Sheep.[Method] The genotypes of BMPRIB gene was identified by the methods of PCR amplification，enzyme digestion and sequencing.And the relationship between the genotypes of BMPRIB and litter size of Hu Sheep was analyzed.[Result]Three genotypes were detected， and defined as AA， AG， GG， respectively. The sequencing results showed that the allele A and G had a base mutation （A746G）， and there was BMPRIB genes polymorphism （AA， AG and GG） in Hu Sheep. The frequency of A allele in Hu Sheep was 0032， the frequency of G allele was 0.968. The frequencies of AA，AG and GG genotype were 0.006， 0.053 and 0.941，respectively. The average litter size of Hu Sheep with AA， AG and GG genotypes were 1.25， 1.81 and 1.96，respectively. [Conclusion]BMPRIB gene might be the major gene for the prolificacy of Hu Sheep， it could be used to select litter size of Hu Sheep.

Key wordsHu Sheep；BMPRIB gene；Litter size

我國綿羊的遗传资源和饲养数量均位居世界第一，但出栏率仅19.6%，与世界平均水平（35%）相比明显偏低[1-2]。湖羊主要分布在江浙一带，是我国著名的一级保护多胎品种。湖羊具有终年发情的特点，且性成熟较早，一年内可以完成出生、配种、产羔，产羔率能达到200%～250%[3-4]。湖羊的繁殖性状是其主要的经济性状之一，这一性状是由多基因控制，因此寻找控制繁殖性状的主效基因对于提高其经济性状具有重要意义。随着现代分子标记辅助选择技术的发展和应用，湖羊繁殖性状的遗传改良有了新的方向和途径。

早在1980年就有研究表明绵羊的多胎性是由控制繁殖性状的基因发生突变所导致的，并将该突变基因初步命名为FecB，该基因的功能是通过增加排卵数而提高产仔数[5-6]。骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）是转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）超家族中最大的亚家族，它们具有多功能性，且在动物机体的各组织器官广泛分布，参与动物的免疫系统、胚胎发育和生殖发育，对哺乳动物的繁殖有着非常重要的影响[7-11]。BMPR-IB基因对子宫内膜的发育有着直接或间接作用[12]。BMPR-IB基因是由可编码502个氨基酸的10个外显子组成，其编码序列长1 509 bp[13]，该基因在骨骼肌、脑和肾脏中有中度表达，最重要的是在与绵羊繁殖有关的各器官（如卵巢、子宫、睾丸和前列腺）中都有广泛表达[14]。研究表明，控制多胎性能的基因是对应于人染色体4q22～23区间的6号常染色体BMPR-IB基因，该基因的1对等位基因A与G相比发生了1处碱基突变（A746G），使携带BMPR-IB突变基因母羊的颗粒细胞分化加快，卵泡成熟加速，进而使排卵数增多[15-16]。此外，一些研究表明Booroola母羊高繁殖力与该突变完全相关[17-20]。笔者研究了湖羊BMPR-IB基因的多态性及其与产羔数的关系，旨在为筛选湖羊多胎性候选基因提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验动物

选取具有第1胎和第2胎生产记录的湖羊，共342只。采集湖羊颈静脉血液约3 mL，并记录耳标号，羊只全部来自于江苏省太仓金仓湖羊场。采血用一次性采血盛血器，并且提前在采血管中加入ACD抗凝剂。血样用冰盒带回实验室后4 ℃下保存，以备提取DNA。

1.2DNA的提取及检测

参照天根生化科技（北京）有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒说明书来提取DNA，-20 ℃下保存。

1.3PCR扩增与酶切

1.3.1PCR扩增。

BMPR-IB引物采用Primer5-blast设计引物的方法，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成，引物序列为：

上游引物为5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′；

下游引物为5′-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3′。

PCR反应体系（25 μL）包括DNA 1 μg、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix（天根生化科技有限公司）12.5 μL，用ddH2O补至25 μL。PCR反应程序如下：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，57 ℃复性90 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃终延伸7 min。将PCR扩增产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2

酶切。用AvaⅡ限制性核酸内切酶进行酶切，酶切体系为20 μL，其中扩增产物为5 μL，限制性内切酶10 U，37 ℃水浴3 h；酶切反应结束后，将20 μL消化液全部加样于2.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后在紫外凝胶成像系统中照相，根据酶切产生的条带确定基因型。

1.4序列测定

将提取的DNA送至无锡翼和应用生物技术有限公司进行测序及基因型鉴定。

1.5数据统计与分析

收集并整理湖羊的生产记录，计算湖羊BMPR-IB不同基因型及基因频率。使用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行统计与分析，对不同BMPR-IB基因型的湖羊产羔数进行LSD多重比较，分析不同基因型与产羔数之间的关系。

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

从342个样品PCR产物中随机抽出9个PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果表明其特异性良好（图1），目的条带长度符合预期，在140 bp左右。

2.2湖羊BMPR-IB基因酶切结果

由于湖羊BMPR-IB基因的1对等位基因A与G相比发生了1处碱基突变（A746G），因此对湖羊BMPR-IB基因经酶切后进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖电泳检测，得到110和140 bp 2种带型（图2）。在所检测的羊群中共有3种基因型，设与PCR原液条带相同的个体为AA基因型，同时含有110和140 bp条带的个体为AG基因型，只含有110 bp条带的个体为GG基因型。

2.3不同基因型测序结果

为确定BMPR-IB基因的突变位点，将AA、AG与GG基因型的PCR产物送交无锡翼和应用生物技术有限公司进行测序。测序结果表明，等位基因A与G相比发生了1處碱基突变（A746G）。测序结果如图3所示。

2.4湖羊BMPR-IB基因型及基因频率

检测结果表明，在342个湖羊样本中，2个为AA型，18个为AG型，322个为GG型。经计算，等位基因G和等位基因A的基因频率分别为0.968和0.032。AA、AG和GG基因型频率分别为0.006、0.053和0.941，湖羊AA、AG和GG基因型的平均产羔数分别为1.25、1.81和1.96。

2.5湖羊BMPR-IB基因的不同基因型产羔数比较

由表1可知，AA、AG、GG基因型第1胎产羔数差异显著（P<005）；AA与AG、GG基因型第2胎产羔数差异显著（P<005），但GG基因型与AG基因型间差异不显著（P≥005）。整体来看，AA与AG、GG基因型的产羔数差异显著（P<005），GG与AG基因型产羔数间差异不显著（P≥0.05）。

3讨论与结论

绵羊作为经济动物，为人们提供肉和毛皮。随着社会的发展，其产量已不能满足人类的需求，主要是因为绵羊为单胎短日照动物，生产力低下，严重限制了绵羊业的发展。湖羊作为我国特有的多胎品种，研究其多胎机制对于绵羊业的发展具有重要作用。

很早以前，育种学家便开始关注湖羊的多胎性，许多学者通过研究湖羊的内分泌机制和表型特点，对其选育进行指导，明显提高了湖羊的产羔率。管峰等[21]对湖羊的BMPR-IB基因进行多态性检测发现，该湖羊群体中只检测出 BB基因，因而在湖羊中的基因效应完全一致，所以认为BMPR-IB基因不是湖羊多胎的主效基因，对该湖羊群体进行选育后仍然可以提高其产羔率。闫亚东等[19]认为湖羊BMPR-IB基因与其他单胎品种差异显著，所以BMPR-IB基因是导致湖羊多胎性状的主效基因。

该试验的样本数为342个，将全部样本送交无锡冀和应用生物技术有限公司测序鉴定基因型，结果发现AA、AG和GG基因型频率分别为0.006、0.053和0.941。對BMPR-IB与湖羊产羔数的关系进行了分析，结果发现AA、AG和GG基因型之间的产羔数存在显著差异，这与吴丽丽等[22]的研究结果相一致，但与管峰等[21]的研究结果不一致，这可能是由于参照对象不同。该试验结果表明，BMPR-IB基因可能是湖羊多胎性能的主效基因，可用于对湖羊产羔数的选择。

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45卷26期杨 媛等BMPR-IB基因多态性与湖羊产羔性能的关系