芭蕉植株上乳酸菌的分离鉴定及抑菌菌株的初步筛选

郗恩光 谭海生 杨劲松 崔坤鹏 张万昌 鞠雪莉 李晓雷 张桂和

摘 要 为分析芭蕉植株（Musa basjoo Siebold）上附着的微生物菌群，并从中分离选育乳酸菌菌株，扩大植物源乳酸菌菌种库，为今后的青贮饲料发酵业和食品发酵工业等提供植物源乳酸菌，运用菌落计数法对样品中的乳酸菌、好氧细菌、霉菌、酵母、芽孢杆菌等进行菌落计数；分离纯化疑似乳酸菌的菌株，对疑似乳酸菌菌株进行生理生化试验、生长速率测定试验和产酸速率测定试验，以此来鉴定其生理生化特性以及属的分类；利用其发酵产物对大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和沙门氏菌（salmonella）和单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）进行抑菌试验。结果显示：样品中均含有好氧细菌（6.5～8.0 log cfu/g FM）、霉菌（6.0～7.7 log cfu/g FM）、酵母（2.0～3.3 log cfu/g FM）、芽孢杆菌（2.0～4.4 log cfu/g FM）及乳酸菌（6.5～7.5 log cfu/g FM）；在芭蕉植株上共筛选出34株疑似乳酸菌菌株，对其进行生理生化鉴定，试验菌株均符合乳酸菌的生理生化特性，其中有4株菌株抑菌效果较好，经鉴定均为植物乳杆菌。

关键词 芭蕉；乳酸菌；分离鉴定；抑菌

中图分类号 Q93-331 文献标识码 A

Abstract This study was aimed to analyse the microbial flora of Musa basioo Siebold， to separate and breed lactobacilli strains， as well as to expand the culture collection of the lactobacilli strains. Colony-counting method was used to count the number of lactobacilli， aerobic bacteria， mycetes， saccharomycetes and bacilli in the samples. Physiological and biochemical characteristics， growth rate and acid production rate of the suspected lactobacilli were analysed， therefore the genera of the suspected lactobacilli were determined. Bacteriostatic experiments were conducted on Escherichia coli， Salmonella and Listeria monocytogenes. Results showed that the sample contained aerobic bacteria（6.5～8.0 log cfu/g FM）， mycetes（6.0～7.7 log cfu/g FM）， saccharomycetes（2.0～3.3 log cfu/g FM）， bacilli（2.0～4.4 log cfu/g FM）and lactobacilli（6.5～7.5 log cfu/g FM）. 34 suspected lactobacilli strains identified as lactobacilli were screened out from the plantain plates. Among the 40 suspected lactobacilli， four were plant lactobacillus.

Key words Plantain； lactobacilli； separation and identification； bacteriostasis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.030

芭蕉（Musa basjoo Siebold）为多年生草本植物。芭蕉的茎是丛生，不分枝的，高可以达到数米，叶子较大，呈长椭圆形，叶表面浅绿色，叶背粉白色。在中国芭蕉多分布于亚热带地区，如贵州、广东、广西、海南、四川、云南和台湾等地[1-2]。芭蕉科芭蕉属植物约40余种，云南连栽培在内的芭蕉属植物约9种，接近中国芭蕉属植物的全部种数[3-4]。枯萎病是影响芭蕉植株正常生长和产量最严重的疾病之一，随着芭蕉种植面积的不断扩大，枯萎病逐渐引起各界学者专家的重视。随着生物防治在农作物病害防治中的优势不断显现，利用内生菌进行枯萎病的防治成为研究热点[5]。

乳酸细菌是一类能利用可发酵糖类产生大量乳酸的细菌通称，乳酸菌菌株广泛分布于自然界中，热带植株及水果中富含各种营养物质及矿质元素，乳酸菌可在其中生息繁殖[6]。热带植物附着的天然乳酸菌种群及生理生化特性一直是各界学者研究的热点。乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值很高。研究表明，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制肠道致病菌定植、提高机体免疫力、改善机体营养状况等作用，因而在多个领域被广泛應用[7]。

海南具有丰富的微生物资源，曾有学者从香蕉茎叶、柱花草等热带植物上成功分离出了大量的乳酸菌资源。但迄今为止，还未见有对芭蕉植株上乳酸菌种资源做过深入系统的研究和有效保藏的相关报道。从芭蕉植株上分离乳酸菌，对其进行分类鉴定，不仅能够掌握乳酸菌在芭蕉植株上的多样性及种群结构，还可以从中筛选出性状优良的乳酸菌，制备发酵食品和发酵饲料专用的优良乳酸菌制剂，为海南发酵食品及畜牧业的发展奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 样品采自海南省儋州市郊外米蕉植株（花、果、茎、叶及根），利用冰盒将样品运回实验室处理。

1.1.2 试剂与设备 蛋白胨；琼脂；牛肉膏；酵母膏；柠檬酸铵（分析纯）；吐温80（化学纯）；葡萄糖（分析纯）；乙酸钠（分析纯）；磷酸氢二钾（分析纯）；硫酸镁（分析纯）；硫酸锰（分析纯）；氯化钠（分析纯）；二甲基亚砜（化学纯）。

SW-CJ-17-D超净工作台；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱；SKP-01电热恒温培养箱；PhS-3E型pH计；UV-1100紫外分光光度计；PL303电子天平；MDF-382E（N）超低温冰箱；YM50FGN全自动高压灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 样品中微生物菌群测定 按照文献[8-11]和微生物菌落计数方法进行。芽孢杆菌菌落数的测定方法：把待测样品稀释液加热到75 ℃，维持10 min，按照微生物菌落计数方法测定芽孢杆菌菌落数。

1.2.2 乳酸菌的分离纯化 取稀释液100 μL，采用涂布法接种到含有1.5% CaCO3的MRS固体培养基中，于37 ℃厌氧培养48 h后，挑取有溶钙圈的单个菌落，分离纯化3～4次[12-15]。

1.2.3 乳酸菌的生理生化鉴定试验 根据文献[16-18]进行乳酸菌的生理生化鉴定试验。

1.2.4 滤纸片法测定乳酸菌发酵产物对条件致病菌抑菌作用 按照文献[19]方法测定乳酸菌发酵产物对条件致病菌的抑菌作用。

1.2.5 乳酸菌的生长速率和产酸速率的测定 将各菌种以3%的接种量，接入液体MRS培养基中，于37 ℃恒温培养，每隔2 h测定各菌种发酵液的pH，并测定其在600 nm处的OD值[9]，绘制产酸速率曲线和生长速率曲线[20]。

2 结果与分析

2.1 芭蕉植株中微生物菌群分析结果

本研究中微生物的计数方式为log cfu/g FM。从表1可以看出，样品中乳酸菌的总数在6.5～7.5 log cfu/g FM之间，好氧细菌总数在6.5～8.0 log cfu/g FM之间，霉菌总数在6.0～7.7 log cfu/g FM之间，酵母总数在2.0～3.3 log cfu/g FM之间，芽孢杆菌在2.0～4.4 log cfu/g FM之间。样品中的微生物菌群中乳酸菌属于优势菌种，酵母菌和芽孢杆菌相对来说较少。

2.2 乳酸菌菌落与菌体特征

从5个样品中共筛出34株疑似乳酸菌菌株，观察各菌株菌落特征，从中选取15株乳白色圆形菌落进行革兰氏染色，并进行镜检，观察菌体特征，如表2所示。由表2可知，15株疑似乳酸菌菌体形态大多是杆状，芭茎4-1为椭圆状；15株疑似乳酸菌菌落均为边缘光滑整齐、乳白色、凸起的圆形菌落。

2.3 乳酸菌生理生化试验结果

将选出的15株疑似乳酸菌菌株进行一系列生理生化鉴定试验，结果如表3所示。

由表3可知，15株疑似乳酸菌菌株的生理生化特性相似，但是不同菌株间的耐酸、耐盐和耐温性能有较大的差异。所有菌株均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、明胶液化阴性、硝酸盐还原阴性，且均不产气；产酸和耐盐性能较好。

在耐酸试验中，所有菌种耐酸性能均较好；在pH=2.5、3.0环境下基本不生长；当pH=3.5、4.0和7.0时长势较好。其中，芭叶6-2耐酸性能最好；芭茎4-1、芭叶5-2和芭根4-1耐酸性能较好，可以作为具有潜在益生特性的耐酸乳酸菌菌株用于下一步的研究。在耐温试验中，所有菌种的耐温性能基本相似，所有菌种在5 ℃环境下不生长；在10、45、50 ℃环境下只有少部分菌种能够生长。其中芭果4-2、芭果5-2、芭茎5-1和芭根4-3在10 ℃环境下长势微弱，耐冷性能较其他菌种较好；芭花6-2、芭果4-3、芭茎5-1、芭叶4-3、芭叶5-2和芭叶6-2耐热性能较好。

2.4 滤纸片法测定乳酸菌发酵产物对条件致病菌抑菌作用

从图1和表4可以看出，各菌株对致病菌均有不同程度的抑制作用，其中芭花5-1和芭叶4-3对大肠杆菌抑制效果最好；芭花6-2、芭茎5-1和芭叶6-2对沙门氏菌抑制效果最好；芭果4-2和芭根4-3对单增李斯特菌抑制效果最好。与同类植物乳酸菌相比较而言，15株菌株对大肠杆菌的抑制效果普遍较好，其中芭叶4-3明显优于同类植物乳酸菌；15株菌株中多数对沙门氏菌和单增李斯特菌的抑制效果优于同类植物乳酸菌。从数据对比来看，15株菌株中大多數菌株的抑菌效果比同类乳酸菌好，可作为以后用于深入研究乳酸菌抑菌特性的潜在菌株。

2.5 乳酸菌生长速率测定结果

根据生理生化鉴定试验和抑菌试验结果，选取5株生物特性较好的菌株进行生长速率和产酸速率测定试验，生长速率测定试验结果如图2所示。由图2可知，在接入3%接种量后，5株菌株在4 h后很快进入对数生长期，菌种快速生长，16 h后进入稳定期，生长速率减缓，18 h后生长基本趋于稳定，整体趋向“S”型。在图中可以看出，芭茎5-1相比其他菌种长势较快，在4～8 h长势迅猛，在12 h后开始进入稳定期；芭根4-3在对数生长期相比其他菌种长势缓和，在16 h后进入稳定期，整体长势偏慢。

2.6 乳酸菌产酸速率测定结果

在测定生长速率的同时，也测定产酸速率，结果如图3所示。由图3可知，接种后，在2～6 h 5株菌株产酸量明显增加，在14 h后进入稳定期，产酸效率减小，20 h后产酸量基本保持不变，pH基本保持恒定，整体呈现“S”型。其中芭茎5-1较其他4株菌株代谢速率较快，产酸性能较好，能在较短的时间内降低环境的pH；芭果4-2比其他3株菌株产酸能力强。5株菌株的产酸情况基本一致，但是还有一些差异，可根据生物特性的不同将其应用到不同的行业中。

2.7 乳酸菌16S rDNA序列分析结果及系统发育树

将分离纯化的芭蕉植株分离菌送至华大基因科技服务有限公司进行DNA提取、PCR扩增及测序，并制作系统发育树。从图4可以看出，Bg4-3与BH6-2和Lactobacillus plantarum系统位置最近，同源性最高；BY6-2和BG4-2与Lactobacillus plantarum strainC、Lactobacillus sp.KLDS 1.0714、Lactobacillus plantarum strain L544属于一个类群，同源性最高，均达到99%以上，与标准菌株序列覆盖率也均达到99%以上。

3 讨论

近年来，对热带植物上乳酸菌的研究已成为热点，徐绍成等[9]从香蕉茎叶中分离出3株产酸性能较好的乳酸菌；翟海瑞[21]从柱花草中分离出4株乳酸菌，分别为海氏肠球菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌霍氏亚种和类植物乳杆菌。本研究全面深入地研究了芭蕉植株上（花、果、茎、叶及根）乳酸菌的多样性和种群分布，分离得到的菌种具有适应期短、生长较快、产酸能力强及产酸速率快等特点。通过本研究可以得知各菌种的生物特性，可选取特性优良的菌株应用到食品工业以及饲料工业生产中。

本研究的样品采自海南省儋州市观光小镇周围野生米蕉植株上（花、果、茎、叶及根）5个部位，利用不同培养基对样品进行微生物菌群测定，从中分离出34株疑似乳酸菌菌株，并对其进行革兰氏染色试验和过氧化氢酶触试验，对疑似乳酸菌菌株进行初步鉴定，并镜检观察各菌种的菌体形态和菌落形态。根据结果从中选取15株代表性菌株，利用传统的生理生化性质测定方法进行初步的种属鉴定，然后对部分菌种进行生长速率和产酸速率试验，以检测菌种的生长状况。试验结果显示，样品中乳酸菌属于优势菌种，选出的15株疑似乳酸菌均符合乳酸菌的菌体、菌落特征以及生理生化特征，所有菌株都具有抑制致病菌生长的特性，4株特性优良的菌株和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，被鉴定为植物乳杆菌。

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