3株海洋红酵母的分离及营养成分分析

吴康 盛哲良 丁立建 何山 朱鹏 严小军 吴小凯

摘 要 从东极岛海域海泥和海水中分离筛选海洋红酵母，对红酵母进行营养成分分析，旨在探讨红酵母作为水产饵料的营养价值。通过形态观察及ITS序列分析鉴定分离酵母菌株，并进行脂肪酸和氨基酸组成测定，评价其营养成分。结果表明：菌株RI21和DONG17被鉴定为海洋胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa），菌株DONG45被鉴定为红冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenum）。3株海洋红酵母的脂肪酸主要组分为C16 ∶ 0、C18 ∶ 0、C18 ∶ 1（n-9）和C18 ∶ 2（n-6）；总氨基酸含量：RI21为346.9 mg/g，DONG17为331.6 mg/g，DONG45为446.5 mg/g。这3株红酵母具有优良的脂肪酸组成、丰富的必需氨基酸，有作为水产养殖饲料的潜在营养价值。

关键词 红酵母；分离鉴定；营养成分；脂肪酸；氨基酸

中图分类号 Q934.1 文獻标识码 A

Abstract In order to explore marine red yeasts as the nutritional value of aquatic baits for isolation and analysis of nutritional compositions of red yeasts from sea mud and seawater around Dongji Island， China. The isolates were identified by the observation of the morphology and the analysis of ribosomas ITS sequences. The contents of fatty acids and amino acids were analyzed. Results showed that the strains RI21 and DONG17 were identified as Rhodotorula mucilaginosa， and DONG45 as Rhodosporidim paludigenum. The main fatty acids of the three marine red yeasts were C16 ∶ 0， C18 ∶ 0， C18 ∶ 1（n-9）and C18 ∶ 2（n-6）， and the total amino acid contents of the three strains RI21， DONG17， DONG45 was 346.9 mg/g， 331.6 mg/g and 446.5 mg/g， respectively. The three strains possessed better fatty acid compositions and rich essential amino acids， and had a potential nutritional value as aquaculture feeds.

Key words Rhodotorula； isolation and identification； nutritional compositions； fatty acids； amino acids

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.007

随着水产养殖业迅猛发展，同时也正面临着一些重大问题如抗生素的过度使用和饵料蛋白源不足等问题。水产养殖的饲料中酵母菌作为益生菌和蛋白营养源被普遍地应用[1]。海洋红酵母是一种广泛存在于海洋环境的真菌，能合成大量胡萝卜素和虾青素[2-3]，含有较高蛋白含量和一定量的不饱和脂肪酸、维生素和微量元素，并在生长过程中产生一些消化酶类、生长因子，这些物质可以促进水产养殖动物对饲料的消化吸收，从而提高饲料的利用率。红酵母常被发现于对虾养殖中，其产生的类胡萝卜素和甘露寡糖具有抗氧化能力，可以在水产动物养殖中推广。富含虾青素的红酵母对鱼油氧化应激反应有还原作用[4]；在饲料中添加红酵母（Rhodosporidium paludigenum）能够提高凡纳滨对虾的生长能力并增强其抗氧化能力[5]，能增强动物体的免疫功能，降低抗生素的使用率[6]。因此，将海洋红酵母作为水产养殖的添加剂进行研究既能解决水产品的药物残留问题又能解决水产养殖的营养源问题，因此可将其作为理想的天然饵料。

目前，对海洋红酵母的研究主要侧重于选育菌种、促进类胡萝卜素合成、优化发酵工艺、评价应用效果以及修饰遗传等方面[7-9]，很少有关于对海洋红酵母的营养组成进行分析的研究报道。本研究对采集的海泥、海水等样品进行高蛋白海洋红酵母的分离鉴定，对分离菌进行营养组分分析，从水产养殖角度对营养价值进行探讨，为海洋红酵母菌在水产养殖方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 QP2010气相色谱-质谱分析仪带AOC-20自动进样器（日本Shimadzu公司）；30 m×0.25 mm×0.25 μm SPB-50色谱柱（美国Supelco公司）；日立L-8800氨基酸分析仪，冷冻干燥机（美国Labconco公司）；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、甲醇、氯仿、无水硫酸钠、氢氧化钠均为国产分析纯。

1.1.2 培养基 YPD培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，海水1 L，自然pH。发酵培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉20 g/L，海水1 L，自然pH。

1.2 方法

1.2.1 海洋红酵母的分离纯化 将从东极岛海域采集的表层海泥、海水样品加入到20 mL无菌YPD培养基中，于25 ℃培养3 d后，将培养液在YPD固体培养基上划线；2 d后再挑取平板上的疑似单菌落（橙色或红色菌落）进行摇瓶培养（28 ℃，150 r/min，72 h）；接着再将培养液在含0.05%氯霉素的YPD固体培养基上划线，进一步获得高纯度的单菌落。

1.2.2 海洋红酵母的形态鉴定 观察YPD培养基琼脂平板上菌落的色泽、质地，表面有否皱褶和边缘形状，在显微镜下观察菌体的形态特征。

1.2.3 ITS序列比对及系统进化树分析 用ITS序列通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行PCR扩增。扩增程序为：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。将PCR产物回收纯化并测序，运用Blast程序在GenBank数据库中进行同源序列搜索；根据同源序列搜索结果，下载相关菌种ITS序列，与本研究测序菌株的序列一同用ClustalX2.1软件进行多序列比对；最后采用MEGA7中的Neighbor-Joining法进行系统树的构建，并用Bootstrap对进化树进行1 000次可信度分析。

1.2.4 菌种发酵 将分离得到的3株海洋红酵母接种到50 mL发酵培养基中，于摇床上培养（28 ℃，150 r/min，48 h），得到种子液；再按10%的接种量接种到250 mL发酵培养基中摇床培养（28 ℃，150 r/min，72 h）；发酵结束后离心收集菌体（转速 8 000 r/min），用蒸馏水洗涤2次，冷冻干燥。

1.2.5 基础营养成分的分析 粗蛋白质含量利用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用Bligh-Dyer法測定；灰分：采用550 ℃燃烧后称量；样品干重：除去总氨基酸含量、粗脂肪及灰分含量的碳水化合物含量。各实验均进行3个重复，取平均值。

1.2.6 脂肪酸组成测定 称取20 mg海洋红酵母干样，参考Bligh-Dyer法，提取总脂肪酸；总脂肪酸提取后加入15 μg C19 ∶ 0作为内标，一并加入2 mL的KOH-CH3OH-H2O中（KOH的质量分数为5%～6%，CH3OH ∶ H2O=4 ∶ 1（V ∶ V），充氮气密封，于60 ℃水浴2 h后冷却至室温；加入1 mL饱和的NaCl溶液，用体积分数为50%的HCl溶液调节pH<1；再加入2 mL氯仿-正己烷（V ∶ V=1 ∶ 4）提取3次，合并提取液后用2 mL重蒸水洗1次，旋蒸干燥；向脂肪酸样品中加入0.5 mL质量分数为14%的BF3甲醇溶液，充氮气密封，于60 ℃水浴甲脂化1 h，冷却至室温；加入1 mL饱和NaCl溶液，分别用2 mL正己烷—氯仿（V ∶ V=4 ∶ 1）提取2次和2 mL正己烷提取1次，合并提取液，加入3 g无水Na2SO4，静置12 h，取上层液旋转蒸干；用0.5 mL正己烷定容，进行GC-MS分析。脂肪酸分析条件：进样口温度250 ℃，载气高纯氦，SUPELCO（30 m×0.25 mm×0.25 μm）SPB-50柱，柱流速0.81 mL/min，柱前压73.0 kPa，柱起始温度150 ℃，保持3.5 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min。分流进样1 μL，分流比50 ∶ 1。EI电离方式：电子能量为70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，选取SCAN模式，质量扫描范围为50～650 m/z，溶剂延迟3 min。根据GC-EIMS-TIC中各组分的离子碎片质量图谱，通过检索NIST库并参考脂肪酸标准谱图进行鉴定，以C19 ∶ 0作为脂肪酸的内标定量分析脂肪酸含量。

1.2.7 氨基酸组成测定 取50 mg海洋红酵母样品经水解后，利用氨基酸分析仪进行分析。氨基酸分析仪分析条件：进样量20 μL；泵1流速0.40 mL/min，压力10.5 MPa；泵2流速0.35 mL/min，压力为0.8 MPa；分离柱温度50 ℃；反应柱温度136 ℃。

2 结果与分析

2.1 海洋红酵母形态特征

分离到的海洋红酵母菌株菌落为中等大小的隆起圆形，菌落表面光滑、边沿平整，有光泽，菌落颜色为单一的橙色；在显微镜下菌体细胞形态为圆形、卵圆形或长形，直径为2～4 μm，多边芽殖（图1）。

2.2 分子生物学鉴定结果

ITS序列分析：通过PCR扩增，获得了3株红酵母分离菌株的ITS序列，利用Blast软件将该片段序列与GenBank中收录的相关DNA序列进行比对，并与相关菌种一起构建系统发育树（图2）。分析表明，菌株RI21和DONG17与GenBank中已发表的Rhodotorula mucilaginosa CBS 10752D的ITS序列有100%的同源性，菌株RI21和DONG17初步被鉴定为胶红酵母。菌株DONG45与已发表的Rhodosporidium paludigenum AUMC 7789的ITS序列有100%的同源性，DONG45初步被鉴定为红冬孢酵母。

2.3 3株红酵母的基础营养组分

从基础营养成分分析结果可看出，3株红酵母的粗灰分含量差异不大（表1），酵母菌含有的矿物质元素是水产养殖动物生长发育以及免疫过程中必要的营养元素。3株红酵母的粗脂肪含量：菌株RI21为5.10%，菌株DONG17为5.70%，菌株DONG45为6.10%。其中菌株DONG45的总氨基酸含量达到49.73%。较好的脂肪酸组成、合理的必需氨基酸组成及其丰富的含量，这些是作为水产养殖动物饲料的重要指标。

2.4 脂肪酸组成分析

本研究所得的3株海洋红酵母的脂肪酸含量间有一定的差异（表2），菌株RI21和DONG17的脂肪酸含量以油酸（C18 ∶ 1）为主，其次是亚麻酸（C18 ∶ 2）和棕榈酸（C16 ∶ 0）。而菌株DONG45的脂肪酸含量以亚麻酸（C18 ∶ 2）为主，油酸（C18 ∶ 1）则次之。EPA（20 ∶ 5n-3）和DHA（22 ∶ 6n-3）是水产养殖动物生长所必须的多不饱和脂肪酸，但3株海洋红酵母脂肪酸中均未发现。

2.5 氨基酸组成分析

氨基酸是具生物功能的大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需的蛋白质的基本物质，而水产养殖甲壳动物成体和幼体中含有10种必需氨基酸[10]。本研究中3株海洋红酵母菌的氨基酸分析结果表明（表3），3株红酵母均含有精氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和色氨酸等10种水产动物必需的氨基酸，尤其是能促进海洋动物生长的赖氨酸和亮氨酸的含量比较高。菌株RI21、DONG17、DONG45的总氨基酸含量分别为346.9、331.6、446.5 mg/g。

3 讨论

随着水产养殖业的蓬勃发展，营养的需求成为限制水产养殖业发展的重要因素。一些微藻以及褐藻被广泛用于水产养殖，但它们的细胞壁很厚，受气候条件制约，且容易被原生动物和细菌污染。而海洋红酵母作为海洋真菌不仅营养丰富，而且发酵时间短细胞密度高。目前，很少见关于高蛋白海洋红酵母营养成分分析及从水产养殖角度将海洋红酵母作为单细胞蛋白进行研究的报道。

本研究通过分离得到3株海洋红酵母，经形态学观察，海洋酵母的细胞直径在2～4 μm，适于作为水产养殖动物幼体的开口饵料和整个幼体时期的饵料。分子生物学鉴定显示，菌株RI21和DONG17为红酵母属胶红酵母，菌株DONG45为红冬孢酵母。红冬孢酵母是海洋红酵母中的有性世代，其代谢产物及应用方面被研究人员归为海洋红酵母进行研究报道。研究表明，红冬孢酵母可以利用甘油生产类胡萝卜素，具有潜在的商业价值[11]。3株海洋红酵母的基础营养中粗灰分含量差异不大，矿物质元素对动物生长繁殖及自身免疫过程起到了至关重要的作用，研究发现，钙和磷是维持对虾的生长所必需。红酵母菌株的碳水化合物主要成分是葡聚糖和纤维素。红酵母的大分子甘露聚糖及糖蛋白复合物是细胞壁的重要组成部分。国内一些研究也证实，免疫多糖对受免异育银鲫免疫应答具有调节作用[12]，对虾、贝类的免疫活性也具有一定的激活作用[13]。

3株海洋红酵母的脂肪酸组成中，均未发现长链多不饱和脂肪酸EPA和DHA，Brown等[14]研究结果表明，酵母菌通常缺少这2种长链多不饱和脂肪酸，因此这些菌株均不能作为单一的饵料食物用在虾类、贝类幼体的养殖培育中，需要添加富含EPA和DHA的藻类，这样方可在营养上得到补充[15-16]，从而也弥补多不饱和脂肪酸在营养上的缺陷。对海洋胶红酵母AMCQ8A的脂肪酸成分进行分析发现，此菌株可作为生产脂质的潜在菌株用于生物柴油的生产[17]。

生物体组织的迅速合成需要充足的蛋白质，海洋甲壳动物的幼体对食物中蛋白需求相当高。在水产养殖动物的饵料中蛋白含量为30%～56%[17-19]。对3株海洋红酵母氨基酸组成进行分析得知，总氨基酸含量如下：菌株RI21为346.9 mg/g，菌株DONG17为331.6 mg/g，菌株DONG45为446.5 mg/g。在凡納滨对虾饲料中，赖氨酸是第一限制性氨基酸[20]，3株红酵母的赖氨酸含量较高，菌株DONG45达到33.75 mg/g。此外，研究表明，含与生物体相近似的必需氨基酸的饵料便可视为最好的饵料[21]。本研究对3株海洋红酵母的氨基酸组成分析结果与Rhishipal等[22]研究结果相似，其氨基酸组成和含量符合水产动物的养殖需求。

本研究通过分离筛选出3株海洋红酵母，经初步鉴定其分别为胶红酵母和红冬孢酵母；对海洋红酵母进行营养组分分析，从水产养殖角度对海洋红酵母菌的营养价值进行讨论，为海洋红酵母菌在水产养殖中的应用提供依据。

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