响应面优化蓝药睡莲总酚水提工艺的研究

臧涛 向东

摘 要 以蓝药睡莲为材料，采用响应面分析法对睡莲花总酚的水提工艺条件进行研究。在单因素试验基础上，选取提取温度、液料比、提取时间为试验因素，利用中心复合试验设计原则进行响应面优化试验，确定最佳提取工艺。结果表明，蓝药睡莲总酚水提的最佳工艺条件为：提取温度74 ℃、液料比 43 ∶ 1 mL/g、提取时间51 min，在此条件下所得总酚提取率为11.5%，与预测值基本相符合，为睡莲花的进一步研究提供了理论依据。

关键词 蓝药睡莲；水提；总酚；响应面法

中图分类号 O625.31；Q949.746.1 文献标识码 A

Abstract The water extraction of total polyphenols from N. stellata Willd was studied by Response Surface Methodology（RSM）. On the basis of single factor experiments， the extraction temperature， liquid to material ratio and extraction time were selected as the experimental factors. The response surface optimization experiment was carried out using the principle of a central composite design. Results showed that the optimum extraction conditions were extracting temperature 74 ℃， liquid-material ratio 43 ∶ 1 mL/g， extracting time 51 min， and the total phenol extraction rate under this condition was 11.5%. The experimental predictions are basically consistent. The study would provide a theoretical basis for further study of lotus.

Key words Nymphaea stellata Willd； water extraction； total phenol； response surface methodology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.025

蓝药睡莲（Nymphaea stellata Willd.）属于睡莲科睡莲属，是一种生长在湖泊和河流岸边的多年生水生热带草本植物，又被称之为星形睡莲、蓝睡莲或延药睡莲[1]。其原产于印度和东南亚，在中国主要分布在海南、广东及云南等地[2]。蓝药睡莲作为尼泊尔、印度以及中国西藏的传统药物，具有广泛的药用价值，不仅具有抗菌、消炎、麻醉、止血、利尿等作用，还可以用于心悸、消化不良、肠炎、腹泻、感冒等治疗[3]。现研究已表明，蓝药睡莲中含有丰富的酚类成分，如槲皮素、山奈酚、没食子酸及它们的衍生物等[4]，具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、预防心血管疾病等多种生物活性[5-8]。

目前，蓝药睡莲产品的开发利用较少，主要应用于鲜切花的观赏和装饰品，鲜切花保存期短，不易贮藏，浪费较严重。中国花茶饮用历史悠久，随着人们生活水平的提高，人们对健康和高品味生活的追求日益增加，蓝药睡莲作为药食两用的资源，不仅可以作为花茶饮用，还可以制备成茶饮料等多种产品，减少了资源浪费，具有广泛的开发利用价值。传统的总酚提取工艺多采用有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等进行提取[9]，容易导致有机溶剂的残留，不利于蓝药睡莲做为药食两用资源在食品、医药中的应用。水提法不仅具有方便、简单、快速、易于实现工业化等优点[10]，而且减少了有机溶剂的使用，具有更加实用的价值和意义。现已有学者对茶叶[11]、光皮木瓜[12]、肉桂[13]等酚类物质水提工艺进行了研究，关于蓝药睡莲总酚水提工艺的研究目前尚未见报道。因此，本试验采用响应面法对蓝药睡莲中酚类物质的水提工艺条件进行优化，得到最佳提取工艺，为进一步深入开发利用睡莲花提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝药睡莲：采自海南省海口市红旗镇。

试剂：Folin-酚（北京索莱宝科技有限公司）；没食子酸（标准品，纯度≥98%，上海英伟生物科技公司）；无水碳酸钠（分析纯，廣州化学试剂有限公司）。

仪器：HH-ZK4电恒温水浴锅（巩义予华仪器有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TS-RO-20L/H超纯水设备（陶氏水处理设备工程有限公司）；SP-722可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理 选取色泽新鲜已开放的蓝药睡莲花，去掉最外层带有绿色的花瓣，切掉花柄，底部花托仅留3～5 mm，将其在60 ℃烘箱中烘干，将花瓣粉碎过80目筛后备用。

1.2.2 没食子酸标准曲线的制作[14] 准确称取没食子酸100 mg，用超纯水溶解并定容至100 mL。分别制得浓度为0.100、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的没食子酸标准溶液；取各浓度标准溶液0.1 mL，加入20 mg/mL 的Na2CO3溶液2 mL。2 min后，加入0.9 mL Folin-酚试剂，反应30 min，用分光光度计测定各组溶液在750 nm处的吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3 睡莲干花中酚类物质的提取及测定 准确称取粉碎后的睡莲干花花瓣，按一定液料比加入蒸馏水，在设定的温度下水浴浸提一定时间后，将浸提液进行抽滤，将滤液移入100 mL容量瓶中，定容，用量程为0.2 mL的移液枪精确量取0.1 mL于10 mL刻度试管中，按1.2.2的方法进行操作，测定其吸光度，根据标准曲线，计算出提取液中总酚的提取率。以不加提取液的空白处理作参比。

1.2.4 单因素试验 以睡莲花总酚的提取率为考察指标，对液料比、提取时间、提取温度进行单因素试验，考察这3个因素对睡莲花中总酚提取效果的影响。

提取温度对睡莲花总酚提取效果的影响：当液料比为30 ∶ 1 mL/g时，分别在40、50、60、70、80、90 ℃下水浴提取40 min后，按1.2.2的方法测定吸光度，计算总酚提取率。

液料比对睡莲干花总酚提取效果的影响：当液料比分别为20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1、60 ∶ 1、70 ∶ 1 mL/g时，分别在70 ℃下水浴提取40 min后，按1.2.2的方法测定吸光度，计算总酚提取率。

提取时间对睡莲花总酚提取效果的影响：当液料比为30 ∶ 1 mL/g，温度为70 ℃时，分别水浴提取10、20、30、40、50、60、70 min后，按1.2.2的方法测定吸光度，计算总酚提取率。

1.2.5 响应面优化试验设计 在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.05b软件，采用中心复合试验设计原则建立数学模型[15]，以睡莲花中总酚的提取率为响应值，对液料比、提取时间、提取温度这3个因素进行响应面试验，优化出最佳提取工艺条件。因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

如图1所示，得回归方程为y=1.317 5x+0.011 2，其相关系数为R2=0.998 4，回归分析表明，在0～1.0 mg/mL浓度范围内睡莲花中酚类物质的质量浓度与吸光度呈良好线性关系，可用于定量分析。因此，利用回归方程，根据吸光度，可计算总酚的提取率。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对总酚提取效果的影响 由图2可知，随着提取温度的增加，总酚的提取率增大，提取液中总酚含量存在差异显著，原因可能是随着温度的增加，酚类物质的溶出率增加，提取率增加，当温度达70 ℃时，睡莲花总酚提取率最高，继续升高温度，总酚提取率稍有下降，这是因为温度升高，部分酚类物质结构可能受高温破坏或被氧化，导致提取率下降。当温度在80～90 ℃之间，差异不显著。因此，在响应面试验时选择60～80 ℃为适宜的提取温度。

2.2.2 液料比对总酚提取效果的影响 由图3可知，液料比对睡莲干花花瓣总酚提取率有显著影响，提取液的总酚含量在不同的液料比中存在显著差异，随着液料比的增加，睡莲花总酚的提取率呈先上升后下降的趋势，当液料比为40 ∶ 1 mL/g时，总酚提取率达最高，这是由于前期液料比较低，酚类物质没有完全溶出，随着液料比的增加，溶出的酚类物质达到最大，继续增加一方面可能由于溶剂增多，其提取液浓度被稀释了，导致提取率下降，另一方面可能是溶剂增大，使其他一些可溶性的杂质溶解的量也逐渐增大，使得多酚提取含量下降[16]。因此，在响应面试验时选择液料比为30 ∶ 1～50 ∶ 1 mL/g为宜。

2.2.3 提取时间对总酚提取效果的影响 由图4可以看出，提取时间对睡莲花总酚提取率具有一定的影响。随着提取时间的增加，睡莲花总酚提取率随提取时间延长而增加，在20～60 min，提取液中总酚含量存在差异显著，当时间为50 min时达到最大；继续延长提取时间，总酚提取率下降，这可能是因为多酚物质较不稳定，随着提取时间的延长导致酚类物质发生氧化分解，从而导致酚类物质提取率下降[17]。在提取时间为60～70 min時，总酚含量差异不显著，因此，在响应面试时选择40～60 min为适宜的提取时间。

2.3 响应面分析

2.3.1 模型的建立与显著性检验 根据单因素试验结果，选取提取温度、液料比、提取时间为影响因素，采用中心复合试验设计原则，进行响应面优化试验，试验方案和结果见表2。利用Design Expert 8.05b软件对试验数据进行回归分析，得到模型对应的二次多项回归方程为：Y=11.36+0.33A+0.34B+0.088C+0.1AB-0.16AC+0.063BC-0.42A2-0.77B2-0.25C2

为进一步验证模型的可靠性，对回归方程进行方差分析，结果见表3。该模型p<0.000 1，为差异极显著，说明该模型回归方程的自变量和因变量的线性关系显著；失拟项p=0.087 9>0.05，不显著，且R=0.989 3，R2Adj=0.979 6，说明该二次回归模型是适当的，模型与实际拟合情况好，误差较小，实验方法可靠。因此，可以利用该模型较好的分析和预测在不同条件下睡莲花中总酚的提取情况。由表3可知，影响因素A提取温度和B液料比对响应值有极显著影响（p<0.01），影响因素C提取时间对响应值有显著影响（p<0.05），此外，AC即提取温度与提取时间之间的交互作用差异为极显著（p<0.01），AB即提取温度与液料比之间的交互作用差异为显著（p<0.05），显著表中各因素的F值可以反映因素对响应值的重要性，F值越大，表明对响应值的影响越大，重要性越大[18]，分析可知，各因素对睡莲花总酚提取率的影响程度大小顺序为：液料比（B）>提取温度（A）>提取时间（C）。

2.3.2 响应曲面的分析与条件优化 响应曲面图和等高线图可以形象的反映响应值随各因素的变化趋势[19]。因此，采用Design Expert 8.05b软件对试验结果进行处理，绘制了提取温度、液料比、提取时间这3个因素之间的交互作用对总酚提取率影响的响应曲面图和等高线图，见图5～7，可以看出液料比的响应曲线陡峭，随着液料比的增大，提取率上升较明显，说明液料比对总酚提取率的影响较大，另外，等高线的形状可以反映两因素之间的交互作用，等高线形状为椭圆形时说明两因素之间的交互作用显著，为圆形时说明交互作用不显著[20]。图6等高线图形状为椭圆形，说明AC之间存在显著的交互作用，图7等高线图形状近似于圆形，说明BC之间的交互作用不显著，这与上述方差分析结果相符合。

利用Design Expert 8.05b软件对总酚提取率的工艺进行优化得到最佳工艺条件为：提取温度74.08 ℃、液料比42.51 mL/g、提取时间50.81 min，预测总酚提取率理论值为11.47%，在此优化条件下，根据实际可操作情况，将工艺调整为：提取温度74 ℃、液料比43 ∶ 1 mL/g、提取时间51 min，经3次试验得到的睡莲花总酚提取率平均值为11.5%，与理论值接近，说明此模型可行。

3 讨论

目前，关于植物多酚提取工艺的研究报道较多，但对蓝药睡莲总酚提取工艺的研究尚未见报道。蓝药睡莲中富含有多种酚类物质，景赞等[14]对蓝药睡莲中多酚类物质抗氧化活性和降糖作用进行了研究，发现蓝药睡莲中酚类物质含量较高，具有明显的抗氧化活性和降糖作用，可广泛应用于功能性食品、医药等行业，而蓝药睡莲在实际作为食品和药品的应用中多采用水进行浸提，因此有必要对其水提工艺条件进行研究。

响应面分析法是一种利用合理的实验设计方法，采用多元二次回归方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，并通过回归方程来寻找最佳响应值的统计方法[16]。该法与传统的正交设计相比，不仅能了解在提取过程中不同因素之间的交互作用程度，而且能更加精确的确定提取工艺的最佳点，对于非线性影响因素的预测指导性更强，具有更好的应用价值[21]。因此，本试验在单因素的基础上，选择对酚类物质含量影响较大的因素，通过响应面分析法对睡莲花总酚提取率的水提工艺条件进行优化，利用Design Expert 8.05b软件，根据中心复合试验设计原则进行试验，建立了合理可靠的数学模型，得到了因素的主效應关系为：液料比>提取温度>提取时间，最后确定最佳的工艺参数为：提取温度74 ℃、液料比43 ∶ 1 mL/g、提取时间51 min。该工艺安全、经济又实用，为睡莲花茶饮料等产品的开发，以及深入研究睡莲花提供了一定的参考价值和理论依据。

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