海南棕榈科植物上的一种新病害

程乐乐 李增平 王贵贵 罗大全

摘 要 对海南棕榈科植物上一种新发现的病害（柄腐病）进行了病原鉴定和致病性测定，并对病原菌进行了生物学特性的测定，为该病的防治提供理论依据。致病性测定表明：从发病植株分离所得菌株在椰子叶柄和槟榔茎杆上成功定殖并扩展，并从变色部位分离得到相同的菌株，表明分离菌为病原菌；通过观察病原菌宏观形态、显微结构和ITS序列分析，确定病原菌为棕榈浅孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]，并在木屑培养基和甘蔗段上成功诱导出该菌的子实体。对棕榈浅孔菌菌丝的生物学特性测定结果表明，30 ℃、连续黑暗、pH5、麦芽糖、大豆蛋白胨或酵母浸膏是菌丝生长最适条件。

关键词 棕榈科植物；柄腐病；棕榈浅孔菌；生物学特性

中图分类号 TQ641 文献标识码 A

Abstract Identification and biological characteristics of the pathogen from the petiole rot disease in palmaceous plants were reported in this study. The pathogenicity of the strain isolated from the diseased plant was tested， the mycelium was successfully colonized and expanded on the coconuts petiole and betelnuts stem， and the same strain was isolated from the discolored part， indicating that the fungus was the pathogen. According to the basidiocarps of the pathogen morphology and microstructure， the pathogen was identified as Grammothele fuligo（Berk.&Broome）Ryvarden， and the fruiting bodies were successfully induced on the sawdust medium and the sugarcane section. Biological characteristics tests showed that 30 ℃， continuous darkness， pH5， maltose， soya peptone and yeast extract were the optimum growth conditions for mycelia.

Key words Palmae； petiole rot disease； Grammothele fuligo（Berk.&Broome）Ryvarden； biological characters

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.022

棕榈科（Palmae）植物是隶属于单子叶植物纲（Monocotytedoneae）、槟榔目（Crecales）的植物，棕榈科植物泛热带分布，生长于南、北纬40°之间[1]。据报道，全世界棕榈科植物约222属2 500种，在中国的南部、西南部台湾、海南岛分布22属72种[2]。棕榈科植物在热带森林中广泛存在，适生于各种环境，是热带雨林植物群落的典型代表[3]。棕榈科植物不仅是海南重要的经济作物（如椰子、槟榔等），很多种类还是重要的景观植物（如大王棕、中东海枣等），它们在热带农业和热带园林中的地位十分重要。覃伟权等[4]记录了棕榈科植物上发生的病害78种，病原多为半知菌类真菌，少数为卵菌门、子囊菌门和担子菌门真菌，极少数为细菌、藻类、植原体和原生动物。目前已报道担子菌门的棕榈科植物病原菌有狹长孢灵芝[Ganoderma boninense]、灵芝[Ganoderma lucidum]、树舌灵芝[Ganoderma applanatum]、南方灵芝[Ganoderma australe]、有害木层孔菌[Phellinus noxius]、假蜜环菌[Armillariella tabescens]、白微皮伞[Marasmiellus candidus]和裂褶菌[Schizophyllum commune][4-10]。笔者在环岛采样时发现有很多种类的棕榈科植物活立木的叶柄基部被一种蓝灰色真菌侵染，初步鉴定为浅孔菌属真菌，引起柄腐症状，取名为柄腐病，此病在海南多个市县均有发生，严重影响了棕榈科植物的观赏价值，对植株的长势亦造成较大的影响。本研究从发病植株叶柄基部采集样本，带回实验室进行种类鉴定、致病性测定和生物学特性测定，为该病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病样 2015年10月至2017年1月，从海南省各市县的棕榈科植物上采集柄腐病样本，编号后带回室内进行分离和鉴定。

1.1.2 供试苗木 1年生甘蔗茎段、4年生椰子幼树、20年生的结果槟榔树。

1.1.3 供试培养基 PDA培养基、Czapek培养基和橡胶树木屑培养基，参考《植病研究方法》[11]和李增平等[12]的方法进行配制。

1.1.4 ITS分析主要试剂 引物为华大基因提供的ITS1和ITS4，DNA Marker DL 2 000，OMEGA Extraction Kit，OMEGA Fungal DNA Kit，Taq-Mixture等，同程乐乐等[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离和致病性测定 菌株分离：采用常规组织分离法分离致病菌[11]。

致病性测定：椰子叶柄接种，先用70%酒精擦拭待接种的4年生健康椰子植株的叶柄背面，再用刀削出六个直径约2 cm的伤口，其中五个伤口接1 cm×1 cm大小的分离菌菌饼，最上一个伤口接空白PDA培养基作对照，用湿棉花保湿并用塑料袋包裹；槟榔茎杆接种，与程乐乐等[13]方法一致。接种后定期观察叶柄症状，每30 d观察1次，并进行拍照和记录。

1.2.2 病原菌鉴定 形态观察参考戴玉成等[14]的方法，观察子实体样本的宏观特征及显微结构，同时进行染色、拍照和使用Imagine Pro Plus 5.0软件测量菌丝及担孢子大小。ITS序列分析与程乐乐等[13]的方法一致。

1.2.3 子实体诱导 橡胶树木屑培养基诱导：将配制好的橡胶树木屑培养基分装在组培瓶（350 mL）中，灭菌120 min。从纯化培养的菌株菌落上挑取直径为1 cm大小的菌饼2块，接种到灭菌好的橡胶树木屑培养基上，置于室温下进行黑暗培养，待菌丝长满培养基时开盖保湿培养，定期观察有无子实体形成。

甘蔗茎段诱导：从纯化培养的菌株菌落上取直径为1 cm大小的菌饼，接种到创伤的甘蔗段上并保湿，在室温下进行黑暗培养，定期观察有无子实体形成。

1.2.4 生物学特性测定 选菌龄一致的培养菌，打取直径5 mm的圆形菌饼，在PDA平板上于ZSH-70型生化培养箱中进行生物学特性测定，每个处理重复4次，待菌落长至培养皿边缘时用十字交叉法测量其直径。分别设置：温度10、15、20、25、28、30、32、35和42 ℃共9个梯度；光照采用15 W照明灯，分别设连续光照、连续黑暗和光暗交替3种处理；pH值设置2、3、4、5、6、7、8、9、10共9个pH梯度；碳源用含碳百分比相同的D-半乳糖、D-果糖、D-木糖、葡萄糖、麦芽糖、α-乳糖、D-山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油共10种碳源分别替换Czapek培养基中的碳源，并以原培养基中的蔗糖碳源和缺碳为对照组；氮源用含氮百分比相同的硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、草酸铵、L-天门冬酰胺、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏共10种氮源分别替换Czapek培养基中的氮源，并以原培养基中的硝酸钠氮源和缺氮为对照组。

1.3 数据处理

利用统计软件SAS 9.1.3、Duncans multiple range test对所测量的数据进行差异显着性分析。

2 结果与分析

2.1 棕榈科植物柄腐病症状

2015年10月至2017年1月，在海南省海口、东方、儋州、三亚、文昌、万宁、昌江、澄迈、定安、乐东、陵水等地调查时均发现有多种棕榈科植物发生柄腐病，病菌寄主主要有中东海枣（Phoenix sylvestris Roxb.）、蒲葵[Livistona chinensis（Jacq.）R. Br.]、椰子（Cocos nucifera L.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）、软叶刺葵（Phoenix roebelenii O. Brien）等，同时发现该病菌可腐生在槟榔（Areca catechu L.）、大王棕[Roystonea regia（HBK.）O.F. Cook]及椰子等棕榈科植物的死树头及倒干上。病菌主要从割叶伤口，风害、虫害等所造成的伤口处侵入叶柄组织，受害叶柄表面组织变褐色至深褐色，病斑边缘具明显的黄色晕圈，后期病斑变枯白色，叶柄失水干缩，内部组织发生白腐，多雨潮湿季节在病部表面或侧面生出蓝灰色膜状担子果。条件适宜时，病菌可沿叶柄侵入茎干内部造成茎干组织白腐，导致病株生长减慢，叶片提早枯黄，树冠明显缩小，严重影响植株长势，重病株后期整株枯死。严重时发病率高达30%（图1）。

2.2 致病性测定

接种60 d后观察叶柄，发现接种部位变为黑褐色，且变色范围大，深入内部组织。对照组只是在伤口边缘略微变黑。取发病变色的组织进行分离，重新分离获得了培养形状与最初分离菌一致的菌株；接种90 d后检查接种分离菌的槟榔植株茎干基部，其基部组织也发生了白腐，对照仅表皮变褐。表明该分离菌为致病菌（图2）。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 形态观察 菌落特征：在PDA平板上纯化后的菌落呈白色（图3-A），菌丝毛絮状，培养一段时间后菌丝变乳白色，绒毛状消失，菌落出现褐色斑块（图3-B）。在组培瓶上培养100 d和在甘蔗段上培养93 d后长出与田间相同的担子果（图3-C、D）。

子实体：子实体平伏生长在基物表面，孔面蓝灰色，管口7～9个/mm（图4-A）。

显微结构：菌丝系统三体型：生殖菌丝无色透明，薄壁，在棉蓝试剂中变成蓝色，直径为1.619～5.008 μm；骨架菌丝灰褐色，厚壁，在棉蓝试剂中不变色，直径为2.154～4.245 μm（图4-B）；缠绕菌丝无色至浅褐色，厚壁，有短小的分枝，在棉蓝试剂中部分变蓝，直径为2.056～3.294 μm（图4-C）；担子无色，薄壁，棍棒状，大小为3.558～4.996 μm，在棉蓝试剂中不变色（图4-D）；担孢子椭圆形或卵圆形，壁光滑，一端有尖状突起，在棉蓝试剂中孢子变蓝，大小为5.652～7.557 μm×2.396～3.386 μm，平均长为6.510 μm，平均寬为2.788 μm，长宽比为Q=1.76～2.68（图4-E）。其形态特征与戴玉成[14]报道的棕榈浅孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]相同。

2.3.2 rDNA-ITS序列比对 测序所得rDNA-ITS序列为608 bp，将其在NCBI上进行Blastn比对，所得ITS序列（NCBI登录号为KY971636）与NCBI登录号为KJ831827.1和KJ831834.1的相似度达100%，与KP012931.1、HQ248224.1、GQ355956.1等的序列相似度达99%，这些序列所对应的真菌为棕榈浅孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]。结合形态学和rDNA-ITS序列分析，鉴定此病原菌为棕榈浅孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]。

2.4 生物学特性测定

2.4.1 不同温度对棕榈浅孔菌菌丝生长的影响

病菌菌丝在15～35 ℃之间均能生长，最适生长温度为30 ℃，低于10 ℃或高于42 ℃时不生长（图5）。

2.4.2 不同光照对棕榈浅孔菌菌丝生长的影响

在所测定的3种不同光照条件下，菌丝在连续黑暗条件下生长速度最快，连续光照和光暗交替条件下生长速度无差异（图6）。

2.4.3 不同pH对棕榈浅孔菌菌丝生长的影响

菌丝在pH 3～7间均可生长，最适生长的pH为5，pH值小于2或大于8时菌丝均不生长（图7）。

2.4.4 不同碳、氮源对棕榈浅孔菌菌丝生长的影响

在测试的碳源中，从菌落平均直径的大小来看，肌醇和蔗糖的菌落平均直径最大，其次是D-半乳糖和麦芽糖，甘油的平均直径最小；从菌落菌丝层生长密度来看，在葡萄糖、D-果糖、麦芽糖和α-乳糖中菌丝层较其它组稍厚些，在D-山梨醇和甘露醇的菌丝层最薄，为一层极薄菌丝。从菌落平均直径大小和形态两方面综合考虑，此菌最适生长的碳源为麦芽糖（表1）。

氮源对菌丝生长的影响：①在非复合氮源中，从菌落平均直径的大小来看，L-天冬酰胺、硝酸铵和硫酸铵的菌落平均直径最大，其次是缺氮、硝酸钾、硝酸钙和氯化铵，硝酸钠的平均直径最小；从菌落生长势来看，在L-天冬酰胺中生长的菌落最浓密，其次是铵盐，在硝酸盐和缺氮中的菌丝层稀薄。②在复合氮源中，从菌落平均直径的大小来看，大豆蛋白胨和酵母浸膏的菌落平均直径比牛肉膏更大，三者的菌丝层厚度相差无几。从菌落平均直径大小和形态两方面综合考虑，此菌最适生长的非复合碳源为L-天冬酰胺、硝酸铵和硫酸铵，最适生长的复合碳源为大豆蛋白胨和酵母浸膏。对于所测定的氮源种类，该病原菌在复合氮源中生长最好，其次为氨基酸类，再次是铵盐，对硝酸盐的利用率最低（表2）。

3 讨论

浅孔菌属真菌遍布于热带，在东非、中国、印度、牙买加、日本、委内瑞拉、夏威夷、伯利兹和巴西的棕榈科植物上均有发现[15]，但鲜有对其致病和生物学特性的相关研究。本研究记述了浅孔菌所致棕榈科植物柄腐病的田间症状，进行了致病測定、形态观察和分子生物学技术鉴定后，确定其为棕榈浅孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]，是一种担子菌门、层菌纲、多孔菌目、多孔菌科、浅孔菌属的病原木腐菌，可引起中东海枣、蒲葵、椰子、油棕、软叶刺葵等棕榈科植物柄腐病，同时可腐生在槟榔、大王棕及椰子等棕榈科植物的死树头及倒干上。浅孔菌属最初是由Berkeley & Curtis等[16]鉴定描述的，原先置于伏革菌科（Corticiaceae s. lat.），因其具有平伏的担子果，不发达、不规则的孔口和受限的子实层的特征[17]，Kirk等[18]其归于浅孔菌科（Grammotheleaceae Jülich）。但是Larsson[19]根据其二体系的菌丝系统和对其DNA序列的分析，将浅孔菌属归属于多孔菌科。本研究中采用Larsson的分类，将棕榈浅孔菌置于多孔菌科（Polyporaceae Corda）。Karasiński等[20]描述了棕榈科植物相关的浅孔菌属真菌Grammothele bolivianus Karasiński，其与棕榈浅孔菌的担子果颜色相似，但菌孔和担孢子比其更大。笔者观察到的菌丝系统和担孢子与戴玉成[14]所描述的棕榈浅孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]特征相符。

棕榈浅孔菌可生长于单子叶植物腐烂组织上，但主要生长在棕榈科植物上，田间调查时在海南南渡江边生长的佛肚竹（Bambusa ventricosa McClure）上发现此菌也能引起其茎腐病。本研究通过对甘蔗茎段接种，成功诱导出了棕榈浅孔菌的担子果，表明棕榈浅孔菌也可在甘蔗茎上腐生。生物学特性测定表明：棕榈浅孔菌菌丝最适生长条件为30 ℃，黑暗、pH5、麦芽糖、大豆蛋白胨或酵母浸膏。棕榈浅孔菌在海南岛分布广泛，几乎全岛均有分布，虽然它为弱寄生的伤口侵入病原菌，但海南台风多，高温高湿的时间长，台风会对椰子、蒲葵、中东海枣、油棕、软叶刺葵等棕榈科观赏植物造成大量伤口，利于棕榈浅孔菌的侵入，在高温高湿的环境中扩展较快，其柄腐病发生严重，建议生产中发现此病后及时清除病残组织，集中后深埋或烧毁，减少侵染来源。同时对积水的栽培园清沟排水，及时砍除病株枯叶和铲除园内杂草，保持园内通风透光，降低湿度，可有效防止柄腐病的发生及扩展。

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