低温对6份柱花草种质生长的影响及抗冷性评价

陈志坚 彭玺如 罗佳佳 刘攀道 李欣勇 丁西朋 郇恒福 刘国道

摘 要 分析了低温（6 ℃）处理对6份柱花草种质地上部鲜重、相对电导率、丙二醛（MDA）含量、叶绿素浓度和最大光化学效率（Fv/Fm）的影响，并比较不同柱花草种质抗冷性的差异。结果表明：低温处理降低了柱花草的地上部鲜重、叶绿素浓度和Fv/Fm值，增加了柱花草叶片相对电导率和丙二醛含量，但是，低温处理对不同种质的影响有所差异。在6份柱花草种质中，种质TF41抗冷能力最强，其他5份种质（TF29、TF57、TF220、TF303和TF2001）抗冷能力较弱。研究结果为柱花草抗冷机理研究及抗冷柱花草品种改良提供了理论依据和种质材料。

关键词 柱花草；低温胁迫；抗冷性评价

中图分类号 S541 文献标识码 A

Abstract Shoot fresh weight， relative electric leakage， malondialdehyde（MDA）content， chlorophyll concentration and maximum photochemical efficiency（Fv/Fm）of six Stylosanthes（stylo）accessions were investigated under chilling stress（6 ℃）. Results showed that the six tested stylo accessions exhibited different responses to chilling stress. The shoots fresh weight， chlorophyll concentration and Fv/Fm of stylo accessions differentially decreased by chilling treatment， while relative electric leakage and MDA content in the leaves of stylo increased under chilling stress. Comprehensive evaluation analysis with subordinate function showed that among the six tested stylo accessions， TF41 exhibited the superior ability of chilling resistance. Taken together， our results not only provide a theoretical basis for dissecting the mechanisms underlying stylo resistant to chilling， but also provide germplasm resources for improving stylo varieties to chilling stress.

Key words Stylosanthes； chilling stress； chilling resistance evaluation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.010

自然界中，低溫胁迫是限制植物生长和发育的重要因素之一。低温容易造成植物机体损伤，导致产量降低，甚至植株死亡[1-2]。低温影响植物对矿质营养的吸收，影响呼吸作用和新陈代谢等生理过程[3]。研究表明，低温处理降低植物叶绿素含量、最大光化学效率（Fv/Fm）和光合速率[4]。低温胁迫会产生超氧阴离子（O2-）、羟自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）等活性氧物质（ROS，reactive oxygen species），ROS的积累会造成膜脂过氧化，增加丙二醛（MDA）含量，破坏细胞结构和功能[5-6]。在长期进化过程中，植物形成了一系列适应低温胁迫的机制，如通过调控抗氧化系统抵抗氧化伤害，增强感受低温信号途径相关基因的表达提高耐低温能力[7-9]。此外，在低温胁迫下，植物体内积累的渗透调节物质，如可溶性蛋白、游离脯氨酸以及可溶性糖含量等，在植物耐低温中发挥着重要作用[10]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是重要的热带豆科牧草，可用于牧草饲料、果园覆盖、绿肥作物以及天然草地改良等。柱花草具有耐贫瘠和酸性土壤、草品质好等特点，已成为热带和亚热带地区广泛种植及应用的豆科牧草。20世纪60年代至今，柱花草已在我国南方各省（区）推广种植，累积种植面积已超过20万hm2[11]。然而，柱花草对低温胁迫较为敏感，10 ℃以下的低温就会导致柱花草叶片失绿变黄，甚至引起植株死亡，严重影响了推广和应用，因此，低温胁迫问题已成为柱花草实际生产和应用中的重要难题[12-14]。

目前，对柱花草响应低温胁迫的机理已有相关的研究报道。低温胁迫显著抑制柱花草的生长，但通过添加外源脱落酸（ABA），能够提高柱花草抗氧化能力、维持较高的最大光化学效率和保护光系统II，从而增强柱花草耐低温能力[15]。并且，研究发现，信号分子NO和Ca2+也参与了ABA提高柱花草抗冷能力的过程中[16-17]。此外，外源水杨酸（SA）和NO供体硝普钠（SNP）处理，也能够提高柱花草抗氧化酶活性，降低叶片相对电导率及MDA含量，从而减轻低温胁迫对柱花草幼苗的伤害[18]。但筛选与培育抗冷柱花草品种是应对低温环境的根本途径，对南方大力发展草牧业具有重要的实际意义。然而，迄今为止，对不同柱花草种质抗冷性评价分析较少，并且，采用的实验方法及评价体系不同，结论不尽相同[19-20]。因此，本研究以6份柱花草种质为材料，分析低温（6 ℃）处理对柱花草生长、相对电导率、MDA含量、叶绿素浓度和Fv/Fm的影响，并运用隶属函数法综合比较不同柱花草种质抗冷性的差异，以期为探索柱花草抗冷机理及抗冷柱花草品种改良提供理论依据及种质材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验共用到6份柱花草种质，编号分别为TF29（Stylosanthes guianensis）、TF41（Stylosanthes grandifolia）、TF57（Stylosanthes hamata）、TF220（Stylosanthes guianensis）、TF303（Stylosanthes guianensis）和TF2001（Stylosanthes guianensis）。柱花草种子来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所草业研究室。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 柱花草种子处理萌发后，播种于盆栽营养基质中（为灭菌土、腐殖土和蛭石按2 ∶ 1 ∶ 1比例的混合物），并于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所草业研究室温室培养。柱花草幼苗正常培养40 d后，移至人工气候培养箱中进行低温处理。实验设置2个处理温度，分别为28 ℃（对照）和6 ℃（低温）。低温处理7 d后，柱花草幼苗转移到28 ℃下恢复生长3 d。分别于低温处理7 d和恢复生长3 d收获柱花草地上部样品，测定各项生理指标。每个处理设置3个生物学重复。

1.2.2 测定项目 收获地上部样品并称取鲜重。质膜透性用电导法测定。丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法[6]。叶绿素含量测定采用分光光度法[21]。叶片最大光化学效率（Fv/Fm）采用Pocket PEA荧光仪（Hansatech，英国）测定。每个指标测定设置3个生物学重复。

1.3 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2003作图，通过SPSS20.0（SPSS Institute，美国）软件进行单因素方差分析。测定指标增加率或降低率=（冷处理下测定值-CK测定值）/CK测定值×100%。当冷处理下各性状测定值>CK各性状测定值，则为增加率；当冷处理下各性状测定值2 结果与分析

2.1 低温处理对柱花草生长的影响

如图1所示，6 ℃低温处理7 d显著抑制柱花草的生长，但不同种质受低温处理影响的程度不一样，其中，种质TF41在低温处理下的表型性状与对照条件下相似，表明其受低温影响较低。低温处理显著抑制了6份柱花草种质的地上部鲜重，相对对照处理，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低温处理下的地上部鲜重分别降低了31.9%、45.4%、38.7%、46.4%、25.8%和16.6%（图2-A）。并且，柱花草经低温处理后，恢复生长3 d，TF41的地上部鲜重相对对照处理下，降低了18.7%，而其他种质地上部鲜重降低了22.2%～63.6%（图2-B）。以上结果表明，在6份柱花草种质中，TF41具有较强的耐低温能力。

2.2 低温处理对柱花草叶片质膜透性的影响

低温处理显著增加了柱花草叶片相对电导率及丙二醛含量（图3）。相对对照处理，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低温处理下的叶片相对电导率分别增加了70.2%、84.4%、84.7%、83.6%、53.7%和39.3%，丙二醛含量分别增加了62.9%、68.7%、60.8%、67.1%、55.9%和44.6%，（图3-A、B）。恢复生长3 d后，相对对照处理，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的叶片相对电导率增加了44.1%～82.4%，而TF41仅增加了18.9%，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的丙二醛含量增加了48.3%～66.4%，而TF41仅增加了29.9%（图3）。以上结果说明TF41叶片质膜透性受低温处理影响低于其他种质。

2.3 低温处理对柱花草叶绿素浓度及最大光化学效率（Fv/Fm）的影响

从图4-A可以看出，低温处理对柱花草叶绿素浓度影响不大，只显著降低了TF2001和TF220叶片叶绿素浓度（分别降低了17.2%和18.5%），但是，恢复生长3 d后，相对对照处理，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的叶绿素浓度降低了49.1%～82.9%，而TF41仅降低了21.8%（图4-A）。低温处理显著抑制了6份柱花草种质的Fv/Fm值，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低温处理下的Fv/Fm分别比对照处理降低了36.9%，40.4%，50.0%，38.3%，42.1%和17.2%，而恢复生长3 d后，Fv/Fm分别比对照处理降低了62.7%，72.3%，66.9%，56.7%，45.3%和26.5%（圖4-B）。以上结果表明，在低温处理下，相对其他种质，TF41能够维持较高的叶绿素浓度及最大光化学效率。

2.4 柱花草种质抗冷性综合评价

本研究进一步对低温处理下，地上部鲜重、相对电导率、丙二醛含量、叶绿素浓度和Fv/Fm等5个指标的变化进行分析，计算隶属函数值，综合评价柱花草的抗冷能力。结果表明，种质TF41综合评价D值最大，为1.000，TF220和TF57次之（分别为0.589 7和0.415 5），TF303、TF29和TF2001最小，为0.141 9～0.230 4（表1）。因此，TF41抗冷能力最强，为抗冷型柱花草，TF220、TF57、TF303、TF29和TF2001为冷敏感型柱花草。并且，从表1可以看出，地上部鲜重、电导率、丙二醛和Fv/Fm与隶属函数值显著负相关，表明以上4个指标可作为柱花草抗冷能力评价和鉴定的参考指标。

2.5 柱花草种质抗冷性聚类分析

对地上部鲜重、相对电导率、丙二醛含量、叶绿素含量及Fv/Fm等5个指标数据结果进行标准化处理，采用欧氏距离，利用离差平方和法，对6份种质材料进行聚类分析。结果表明柱花草种质在欧氏距离为3.63处可以分为2个类群（图5）。第1类群只有种质TF41，各项指标受低温处理影响较小，认为是抗冷型柱花草；第2类群包括种质TF220、TF57、TF2001、TF303和TF29，各项指标显著受到低温处理的影响，属于冷敏感型柱花草（图5）。

3 讨论

低温胁迫是限制植物生长和发育的非生物胁迫之一。低温条件下柱花草生长明显受到抑制，严重的低温胁迫会导致柱花草植株死亡[14]。本研究发现，6份柱花草种质在受到低温胁迫时，会导致地上部鲜重降低，这与Lu等[6]和Bao等[14]在柱花草中的研究结果相似，低温处理显著抑制柱花草的生长。在低温条件下，种质TF41能够维持较高的生物量，表明其具有较强的耐低温能力。在低温胁迫下，维持较低的相对电导率和MDA含量，说明细胞膜受到膜脂过氧化程度较低，抗寒性强[5-6]。在本研究中，6份柱花草种质受到低温胁迫后，相对电导率和MDA含量显著增加，冷害造成膜脂过氧化。这与柱花草、黄瓜、核桃和越橘的研究结果相似，寒害造成膜脂过氧化，导致相对电导率和MDA含量增加[6，23-24]。并且，在低温处理和恢复生长条件下，种质TF41的相对电导率和MDA含量增加率最小，表明TF41叶片质膜受低温处理的影响低于其他种质。

低温胁迫直接影响叶绿体中酶的活性，从而影响叶绿素的合成，并且，叶绿素荧光参数中最大光化学效率可有效的反映PSⅡ受到低温伤害的程度[4]。本研究发现，低温处理显著抑制了6份柱花草种质的Fv/Fm值，但相对其他种质，TF41能够维持较高的叶绿素浓度及Fv/Fm，表明TF41抗冷能力高于其他种质。类似的，低温处理显著降低了柱花草“热研4号”叶绿素浓度、Fv/Fm和光合速率，进而抑制了光合作用[4]。在对玉米耐寒性分析中也有类似报道[25]，可见低温胁迫对叶绿素含量和Fv/Fm有重要影响。

植物抗寒是一个复杂的生理生化过程，受到多种因素的影响，单一指标作为抗寒指标的直接评价难以全面反映植物的真实抗寒情况，需要以多个指标为依据进行综合评价植物的抗寒性[19，22]。因此，本研究运用隶属函数法，综合比较不同柱花草种质抗冷性的差异。结果表明，TF41抗冷能力最强，为抗冷型柱花草，其余5份种质为冷敏感型柱花草。并且，聚类分析结果表明6份柱花草种质的抗冷性可以分为2个类群，第1类群只有种质TF41，第2类群包括其余5份种质，与抗冷性综合评价结果一致，进一步说明种质TF41具有较强的抗冷能力。

综上所述，在6份柱花草种质中，种质TF41抗冷能力最强，为抗冷型柱花草。研究结果发现地上部生物量、电导率、丙二醛含量和Fv/Fm等4个指标可作為柱花草抗冷能力评价和鉴定的参考指标。本研究为柱花草种质的创新利用及抗冷柱花草品种改良提供了理论依据及新的种质材料，并且，种质TF41可作为柱花草抗冷机理研究的重要材料，其抗冷机理值得做进一步的分析。

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