褪黑素对雌性动物繁殖影响的研究进展

张珍珍，何长久，刘国世

（中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

褪黑素对雌性动物繁殖影响的研究进展

张珍珍，何长久，刘国世*

（中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

编者按

2017年《中国畜牧杂志》全面改版。为更好展示畜牧学领域的科技前沿，促进学术交流，本刊特别邀请不同领域的专家或青年骨干，围绕各自的研究领域，介绍自己、团队或国际研究机构近几年的研究成果、存在问题及研究展望，或就当前的研究热点问题进行讨论和评论。2017年第一期自副主编开始，将为读者带来相关综述，希望能引发读者对相关热点、难点的思考，并进行深入探讨。

卵母细胞和颗粒细胞是构成哺乳动物卵泡的主要细胞类型。排卵后，成熟卵母细胞经受精进入胚胎发育阶段并通过植入子宫与母体建立联系，而颗粒细胞则继续留在卵巢内与卵泡膜细胞一起分化形成黄体。因此，卵母细胞成熟、黄体形成、胚胎发育与胚胎附植是家畜繁殖学研究的核心内容。褪黑素（Melatonin, MLT）是由动物松果体[1]产生的神经内分泌激素，既是高效的活性氧[2]（Reactive Oxidative Stress, ROS）清除剂，也是重要的生殖激素。褪黑素也存在于藻类、植物等绝大多数生物机体中，是一种重要的生理调节剂。近年发现动物多种组织和器官中都有褪黑素合成。已知褪黑素在动物免疫调控[3]、物种进化[4]、抗癌[5]、抗衰老[6]等方面都发挥重要作用，有关MLT与雌性生殖关系的研究，仍亟待探索。近年的研究表明褪黑素在动物性成熟、激素分泌、卵泡发育、黄体功能、排卵、妊娠和分娩过程中发挥着广泛的作用。本文主要综述了国内外特别是本实验室在繁殖领域的最新研究进展，特别是褪黑素作用于生殖细胞的具体机制、合成来源以及生产应用试验方面。

1 卵巢局部褪黑素旁（自）分泌信号参与排卵调控

在促黄体素（Luteinizing Hormone, LH）峰后，褪黑素可通过褪黑素Ⅰ型（MT1）受体调控卵泡颗粒细胞黄体化。排卵前，雌激素诱导垂体LH峰的形成，从而激发卵母细胞成熟分裂与颗粒细胞黄体化。本实验室在小鼠和牛的研究中发现[7]，排卵前LH峰能诱导颗粒细胞中MT1表达水平呈现数百倍上升，在持续4 h后恢复到基础水平，并将之命名为排卵前MT1峰；而同一时期，卵丘细胞中的褪黑素合成酶SNAT（即AANAT）基因的表达水平也极显著上升，引起卵泡液中的褪黑素水平升高。以上研究表明，MLT/MT1是LH的下游信号分子，并推测MLT/MT1信号极有可能调控颗粒细胞黄体化。本实验室进一步验证了上述推测，发现在MT1受体峰前补充外源褪黑素可以改善小鼠新生黄体的功能，血清中孕酮水平显著上升，胚胎附植点数以及产仔数均显著增加。收集颗粒细胞进行LncRNA以及mRNA测序，发现褪黑素主要是通过调控PI3KAkt信号通路、细胞基质受体（ECM-Receptor）互作，影响黄体细胞外基质重塑和血管形成，从而调控颗粒细胞黄体化[7]。这表明，卵泡局部存在调控黄体化的褪黑素旁（自）分泌信号，即在排卵过程中，LH分别诱导卵丘细胞合成褪黑素和颗粒细胞产生MT1峰，随后卵丘细胞合成的褪黑素以旁分泌的方式作用于颗粒细胞上的MT1受体，通过PI3K/ Akt、外基质重塑信号调控黄体形成。

排卵过程中，线粒体合成的褪黑素可促进卵母细胞成熟。早期研究表明[8]，外源褪黑素能够促进牛的卵母细胞体外成熟，显著提高体外受精胚胎发育潜力，说明褪黑素可能直接参与卵母细胞成熟调控；本实验室进一步实验确认了卵母细胞中褪黑素的来源，证实排卵过程中卵母细胞线粒体合成大量褪黑素[9]，卵泡液中褪黑素浓度也显著高于同时期血清水平。此外，研究发现褪黑素通过改善线粒体功能提高卵母细胞成熟质量[9]：一方面，褪黑素促进线粒体在卵内正常分布，并通过提高线粒体DNA（mtDNA）拷贝数与膜电位（MMP）增加ATP合成，从而促进卵母细胞减数分裂中期纺锤体组装；另一方面，褪黑素能抑制线粒体呼吸链代谢过程中活性氧的产生，降低卵母细胞内游离碱基氧化产物8-oxodG水平，从而降低DNA氧化损伤，并通过影响凋亡相关基因（Bcl-2、Caspase3）的表达，抑制卵母细胞凋亡[9]。褪黑素还作用于卵母细胞上褪黑素受体MT1，通过上调卵丘扩展基因PTX3和HAS1表达促进卵丘扩展，同时上调EGFR的表达水平，增强LH（或hCG）的作用，进而促进卵母细胞成熟相关基因MARF1的表达，提高卵母细胞成熟效率[8]。以上结果表明，褪黑素是卵母细胞在长期进化过程中所形成的用于抵御排卵过程中氧化损伤的重要分子。

2 早期胚胎发育过程中，褪黑素可通过MT1受体促进胚胎发育

本实验室发现外源褪黑素可以显著提高体外胚胎的发育效率，并证实褪黑素受体MT1在牛胚胎早期发育阶段（原核胚、2-细胞胚、8/16细胞胚、囊胚）中持续表达，8/16细胞胚胎表达水平最高[8]。利用受体抑制剂Luzindole阻断胚胎MT1受体后，褪黑素对胚胎发育的促进作用减弱，这证实褪黑素促进早期胚胎发育是通过MT1受体介导的；进一步研究证实，褪黑素通过MT1受体下调胚胎中第二信使cAMP的水平，影响cAMP/PKA的下游通路，进而调控Dnmt1a、SLC2A1、ErbB1基因，促进囊胚葡萄糖转运、基因组表观修饰以及囊胚激活，从而显著提高原核胚体外发育的囊胚率、囊胚孵化率和囊胚细胞数。此外，添加褪黑素体外培养小鼠原核胚胎发育到囊胚，移植后的妊娠率、平均产仔数和后代成活率分别提高了40.1%、52.4%、15.6%[10]；褪黑素还能改善囊胚线粒体功能，抑制凋亡基因p53、Bax和Caspase3的表达，促进抗氧化基因GPx4和SOD1表达，从而抑制囊胚细胞内线粒体凋亡途径，并减少囊胚氧化损伤，提高囊胚质量[9]。这进一步表明，褪黑素还可通过抗氧化及抗凋亡作用促进胚胎体外发育效率和提高囊胚质量。

3 胚胎附植过程中，褪黑素通过MT2受体促进子宫接受态的形成

人排卵前大卵泡中MT含量高于小卵泡，MT含量和孕酮（P）呈正相关[11]。人子宫上，存在具有功能的MT1受体和褪黑素Ⅱ型（MT2）受体，妊娠和非妊娠状态下表达情况不同，影响子宫的昼夜收缩节律和分娩。女性月经周期中血清褪黑素含量黄体期较卵泡期高，颗粒细胞-黄体细胞上有褪黑素结合位点，褪黑素能直接激活黄体细胞分泌P；同时，褪黑素(10 pM-100 nM)能显著提高黄体细胞LH受体的表达[12]。在大鼠上，切除松果体后胚胎附植点显著减少，雌二醇（E2）上升，P下降，补充外源褪黑素后恢复正常[13]。本实验室进一步发现，MT2受体在妊娠第2天的子宫腔上皮与子宫腺内特异表达，褪黑素合成酶基因SNAT在妊娠后表达水平持续上升。对妊娠小鼠进行持续外源褪黑素处理，采集妊娠第4天子宫进行组织学分析，褪黑素能显著增大子宫内膜面积，增加内膜中子宫腺的密度和面积，并且促进小鼠胚胎附植[14]。以上研究表明褪黑素在胚胎附植过程中发挥重要作用。

4 褪黑素可抵御环境应激

环境应激造成家畜繁殖力下降，每年给畜牧业带来了不可估量的损失，是畜牧生产中难以解决却又不得不面对的难题。热应激是一类典型的环境应激，容易造成母畜卵泡闭锁、卵泡细胞凋亡以及卵母细胞成熟异常。本实验室前期研究表明，猪的卵母细胞在热应激状态下，自身会合成大量的褪黑素，后续研究证实褪黑素能够显著提高热应激猪卵母细胞的成熟效率[15]。并发现褪黑素可以抑制羊颗粒细胞的凋亡[16]。本实验室还发现植物抗氧化剂白藜芦醇可通过Mos/MEK/p42通路促进卵母细胞体外成熟[17]；同时白藜芦醇也能通过缓解热应激带来的氧化损伤，通过改善线粒体功能从而保护猪卵母细胞体外成熟，但效果弱于褪黑素[15,18]；褪黑素和白藜芦醇共同添加时，缓解热应激作用最佳[18]。

5 展 望

本文综述了褪黑素在哺乳动物上的繁殖调控作用，包括提高卵母细胞成熟、胚胎发育、附植效率和改善黄体功能，减少应激等。我们将上述成果运用于家畜和家禽的实际生产，发现：①荷斯坦奶牛（体细胞数在30～100万/mL）连续4 d皮下注射4.64 mg褪黑素能显著提高血液中白蛋白含量，降低皮质醇、白细胞、淋巴细胞水平，提高机体免疫力，降低牛奶体细胞数，使奶中体细胞数从42.52±5.17万/mL降低到26.24±4.22万/mL，降幅近40%[19]。②配种时皮下注射2 mL褪黑素复合抗氧化剂可以将春季奶牛产后首次配种受胎率由38.32%提高到46.83%，夏季奶牛产后首次配种受胎率由25.00%提高到38.89%[7]。③给受体羊埋植40mg褪黑素可以将原核胚微注射外源基因胚胎移植受胎率由14.3%提高至31.3%[20]。④给超数排卵供体梅花鹿埋植40mg褪黑素可以将其黄体数量由5.75个提高至9.75个[21]。⑤产蛋高峰期后埋植适当剂量褪黑素能够抑制产蛋性能下降，能使产蛋率提高，并能提高总蛋重，降低沙皮蛋率及沙破蛋率，但能够降低平均蛋重和蛋黄色泽；最佳埋植时间360日龄左右，最佳剂量10mg，有效期至少3个月，产蛋率平均提高约4%～8%[22]。此外， Farez等[3]发现，人类免疫疾病多发性硬化症发病率与体内褪黑素水平相关，当体内褪黑素水平升高可以改变免疫细胞Th17和Tr1细胞的增殖进而抑制该病的发生。这提示我们，褪黑素在预防和治疗雌性动物繁殖障碍疾病上还有许多潜在作用。

综上所述，一定剂量的褪黑素，可以保证动物正常的生理功能，改善其繁殖性能。目前，组学、表观遗传等先进技术手段在生殖生理学领域的进一步应用，将有助于深入揭示褪黑素在动物生殖调控上的作用通路和分子机理。

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10.19556/j.0258-7033.2017-06-001

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2014CB138 505）

张珍珍（1992-），女，在读博士，研究方向：动物配子和胚胎发育调控机制，E-mail: free1534677917@gmail. com

* 通讯作者：刘国世（1972-），男，教授，博导，研究方向：动物配子和胚胎发育调控机制及繁殖技术，E-mail: gshliu@cau. edu.cn