RNF180启动子区甲基化在前列腺癌中的作用机制

王海光，姜华茂，左知润，龙湟哲，袁观远，贾凡振

（锦州医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁锦州121001）

RNF180启动子区甲基化在前列腺癌中的作用机制

王海光，姜华茂，左知润，龙湟哲，袁观远，贾凡振

（锦州医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁锦州121001）

目的通过检测RNF180启动子区甲基化改变来阐明前列腺癌发生和演进过程中RNF180表达的意义。方法分别采用Western blotting、RT-PCR、甲基化特异性PCR（MSP）及亚硫酸氢盐测序（BSP）法检测人前列腺癌细胞系（PC3、LNCap和DU145）与人正常前列腺上皮细胞（RWPE-1）中RNF180的表达情况；采用免疫组化法检测人前列腺癌组织芯片上前列腺癌及癌旁组织中RNF180蛋白的表达。结果前列腺癌细胞中RNF180基因的mRNA及蛋白的表达量明显低于正常前列腺上皮细胞（P＜0.05），而前列腺癌细胞中RNF180启动子区的甲基化水平却明显高于正常前列腺上皮细胞；RNF180蛋白在前列腺癌组织中的表达量明显低于相应的癌旁组织。结论RNF180启动子区在前列腺癌细胞中呈高度非完全性甲基化状态，这也可能是RNF180在癌细胞和癌组织中表达下降或沉默的原因之一。

前列腺癌；RNF180；启动子区甲基化

RNF180是一种新发现的抑癌基因。研究［1-3］表明，胃癌组织中RNF180启动子甲基化频繁，在总体生存率较差的胃癌患者中RNF180的表达降低或消失；RNF180基因在正常肝组织中未发生甲基化，而在肝细胞癌组甲基化率较肝硬化组高，提示RNF180启动子区域高甲基化能促进肝硬化到肝细胞癌的发展进程，可能是导致肝细胞癌形成的原因之一。目前关于前列腺癌中RNF180启动子的甲基化情况尚未见报道。因此，本研究拟通过多种检测方法从多个层面研究RNF180启动子区甲基化改变情况，并探讨其与前列腺癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

人前列腺癌细胞系（PC3、LNCap和DU145）与人正常前列腺上皮细胞（RWPE-1）购自沈阳百思生物科技有限公司；前列腺癌组织芯片购自西安艾丽娜生物科技有限公司；RNF180一抗购自美国Sigma公司；全蛋白提取试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、兔抗体免疫组化（SP法）试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司；EZ DNA Methylation-Gold™Kit、Zy-moTaq™PreMix购自德国ZYMO RESEARCH公司；RNA提取试剂盒、逆转录反应试剂盒购自日本Ta-KaRa公司；2×GreenstarTMqPCR Master Mix购自韩国BioNeer公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：按照常规方法进行细胞复苏、换液、传代、收集和冻存。

1.2.2 Western blotting：收集生长状态良好的前列腺癌细胞系（PC3、LNCap和DU145）与正常前列腺上皮细胞（RWPE-1），提取蛋白，检测浓度并定量。取上述蛋白制品（20 μL/孔）行12%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗室温孵育2 h，加二抗室温孵育1 h，ECL发光显影，采用ScnImage软件测量灰度值。

1.2.3 亚硫酸氢盐测序PCR（bisulfite-sequeneing PCR，BSP）和甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）：收集细胞并提取DNA，按照EZ DNA Methylation-Gold™Kit试剂盒说明书进行亚硫酸氢盐修饰（引物设计、PCR反应体系、扩增条件见表1～3）。行BSP，扩增结束后从50 μL反应体系中取10 μL行2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，若目的条带清晰无杂带，则对其余40 μL体系进行DNA测序。行MSP，取20 μL反应体系行2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察。

1.2.4 RT-PCR：收集细胞并提取RNA，按照逆转录反应试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA，行PCR（引物设计、PCR反应体系、扩增条件见表1～3）。扩增结束后取10 μL体系行2%琼脂糖凝胶电泳。同时取上述cDNA制品行实时荧光定量PCR检测，反应体系为2×GreenStarq PCR Master Mix 10 μL、上下游引物（100 μmol/L）各0.05 μL、DEPC水6 μL、cDNA样本4 μL。

表1 引物设计序列Tab.1 Primer sequence

表2 PCR反应体系Tab.2 PCR reaction system

表3 PCR反应条件Tab.3 PCR reaction conditions

1.2.5 免疫组化：前列腺癌组织芯片（表4）于60℃烤片10 min后，脱蜡及复水，采用EDTA法进行抗原修复，于湿盒中30%H2O2室温避光孵育15 min。按照试剂盒说明书进行免疫组化（SP法）染色，苏木精复染切片，用1%盐酸乙醇分化数秒，自来水返蓝，脱水透明，中性树胶封片。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。2组间数值差异的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表4 前列腺癌组织芯片患者详细信息Tab.4 The detailed information of prostate cancer patients

2 结果

2.1 Western blotting结果

RNF180蛋白在正常人前列腺上皮细胞中高度表达，在人前列腺癌细胞PC3中的表达轻度下降，而在人前列腺癌细胞LNCap和DU145中的表达明显下降（图1）。

图1 RNF180蛋白表达Western blotting检测结果Fig.1 Western blotting results of RNF180 expression

2.2 BSP、MSP结果

根据BSP法结果计算RNF180启动子甲基化率，RWPE-1、PC3、LNCap、DU145分别为9.8%、31.7%、82.9%、85.4%（图2）。提示正常前列腺上皮细胞中RNF180启动子区甲基化率明显低于前列腺癌细胞。MSP结果显示，正常前列腺上皮细胞中RNF180启动子区甲基化水平明显低于非甲基化水平，而LNCap和DU145的甲基化水平明显高于非甲基化水平，PC3的甲基化水平则略低于非甲基化水平（图3）。提示人前列腺癌细胞RNF180启动子区发生了非完全甲基化。

图2 PCR扩增产物及BSP检测结果Fig.2 PCR product and BSP results

图3 RNF180启动子区甲基化MSP检测结果Fig.3 MSP results of RNF180 promoter methylation

2.3 RT-PCR结果

正常前列腺上皮细胞（RWPE-1）中RNF180 mRNA的表达水平明显高于前列腺癌细胞系（PC3、LNCap和DU145）（图4）。实时荧光定量PCR检测结果与上述结果基本一致（图5），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 RT-PCR检测RNF180 mRNA表达结果Fig.4 RT-PCR results of RNF180 mRNA expression

图5 荧光定量PCR检测前列腺正常上皮细胞与前列腺癌细胞中RNF180基因mRNA的相对表达量Fig.5 The mRNA expression levels of RNF180 in normal prostate epithelial cells and prostate cancer cells,as detected by real-time fluorescent quantitative PCR

2.4 免疫组化结果

在本研究的10例前列腺癌样本中，RNF180蛋白在前列腺癌组织中的表达水平均明显低于相应的癌旁组织（图6）。

3 讨论

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤［4］。随着生活方式及饮食结构的改变，过去10年中，我国前列腺癌粗发病率为2.98/10万～17.69/10万，总体呈增长趋势［5］。随着生物大规模分型技术的发展，DNA甲基化正在成为一类充满希望的生物标志物，DNA高甲基化状态在恶性肿瘤中几乎普遍存在［6～7］。RNF180是一种新发现的抑癌基因，其编码产物环指蛋白180是环指蛋白家族的一种新成员，参与包括肿瘤的发生发展在内的多种生物流程［8］。

图6 前列腺癌及相应癌旁组织中RNF180蛋白的表达Fig.6 Expression of RNF180 protein in prostate cancer and paired adjacent non-tumor tissues

研究［9～10］表明，前列腺癌组织中GSTP1和RASSF1A基因启动子区的甲基化率均高于正常前列腺组织，提示GSTP1启动子区甲基化与前列腺癌的进展相关。研究［11］证实，在非小细胞肺癌、结肠癌、前列腺癌中，KEAP1基因由于启动子区高甲基化改变导致该基因呈低表达。CHEUNG等［1］和DENG等［2］的研究表明，RNF180在胃癌的发生中发挥肿瘤抑制因子的作用，且启动子区甲基化改变导致RNF180表达下降；UDALI等［12］的研究表明，RNF180启动子区的高度甲基化在酒精相关性肝癌的发展中起着重要作用。本研究检测了前列腺癌细胞和组织中RNF180基因的表达情况，Western blotting、RT-PCR及免疫组化结果显示，RNF180基因在正常前列腺细胞及组织中的表达水平明显高于前列腺癌细胞及组织，提示前列腺癌细胞及组织中表达异常的RNF180与异常的转录和翻译过程有关。BSP和MSP结果显示，正常前列腺细胞中RNF180启动子区的甲基化程度明显低于前列腺癌细胞。表明前列腺癌细胞和组织中RNF180启动子区的甲基化程度与RNF180mRNA及蛋白的表达水平呈负相关，这可能是RNF180在癌细胞和癌组织中表达水平下降或沉默的原因之一。

研究［13］证实，外周血与癌组织中RNF180甲基化的检测结果一致；ZHANG等［14］的研究表明，外周血中RNF180与SFRP2的联合检测最适合于胃癌的诊断；临床研究［15］证明，RNF180的甲基化检测在临床诊疗中可以作为一个独立的预后因子。由此可见，进一步深入探讨RNF180的作用机制，可能为临床上肿瘤的诊断与治疗提供新的方法和线索。

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（编辑 王又冬）

RNF180 Promoter Methylation in Prostate Cancer

WANG Haiguang，JIANG Huamao，ZUO Zhirun，LONG Huangzhe，YUAN Guanyuan，JIA Fanzhen

（Department of Urology，The First Affiliated Hospital，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China）

Objective To clarify the significance of RNF180 expression in carcinogenesis and progression of prostate cancer by detection of RNF180promoter methylation.MethodsRNF180 expression was detected in human prostate cancer cell lines（PC3，LNCap，and DU145）and normal prostate cells（RWPE-1）via Western blotting，RT-PCR，methylation-specific PCR（MSP），bisulfite-sequeneing PCR（BSP），respectively，while RNF180 expression in human prostate cancer tissues and paired adjacent non-tumor tissue was detected via immunohistochemistry.ResultsThe expressions ofRNF180mRNA and protein in prostate cancer cells were significantly lower than those in normal prostate cells（P＜0.05），opposite to what was observed for the methylation level of theRNF180promoter.Additionally，the RNF180 expression in prostate cancer tissue was significantly lower than that in paired adjacent non-tumor tissue.ConclusionTheRNF180promoter is incompletely methylated in prostate cancer cells，which may be a reason for the decline or silencing ofRNF180expression in cancer cells and tissues.

prostate cancer；RNF180；methylation of promoter

R737.25

A

0258-4646（2017）06-0561-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.019

王海光（1990-），男，硕士研究生.

姜华茂，E-mail：lyyyjhm@163.com

2016-07-06

网络出版时间：