丙戊酸对百草枯与脂多糖诱导的巨噬细胞炎性极化的作用

2017-06-09曾仁庆吴曦子赵洋子邓云蕾于诗源李蕙伊刘畅范晨玲王红崇巍

中国医科大学学报 2017年6期

曾仁庆，吴曦子，赵洋子，邓云蕾，于诗源，李蕙伊，刘畅，范晨玲，王红，崇巍

（1.中国医科大学附属第一医院急诊科，沈阳110001；2.中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳110001；3.中山大学附属肿瘤医院神经外科，广州510080；4.中国医科大学附属第一医院内分泌科，沈阳110001）

曾仁庆1，吴曦子1，赵洋子1，邓云蕾2，于诗源3，李蕙伊1，刘畅1，范晨玲4，王红4，崇巍1

目的分析组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂丙戊酸（VPA）对百草枯（PQ）和脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎性极化的作用。方法小鼠巨噬细胞RAW264.7 37℃、5%CO2条件下培养，稳定传代后分组，分别给予以下处理:（1）PQ；（2）PQ+VPA（HDACⅠ和Ⅱa类抑制剂）；（3）PQ+Apicidin（HDACⅠ类抑制剂）；（4）PQ+MC1568（HDACⅡa类抑制剂）；（5）LPS；（6）LPS+ VPA；（7）LPS+Apicidin；（8）LPS+MC1568。8 h后收集各组细胞上清及细胞团，RT-PCR、ELISA及流式细胞检测巨噬细胞表型标志物的表达。结果PQ与LPS均促进巨噬细胞向促炎表型极化；VPA、Apicidin和MC1568均抑制PQ、LPS诱导巨噬细胞表型极化作用，但抑制作用不完全相同。结论VPA抑制PQ和LPS诱导的巨噬细胞促炎活性，但对PQ和LPS的作用方式各有特点。

百草枯；脂多糖；丙戊酸；巨噬细胞；表型转化

急性百草枯（paraquat，PQ）中毒和脓毒症是我国医院急诊科常见的危重症。无论是急性PQ中毒的氧自由基损伤，还是脓毒症的病原体感染，均可引发过度炎症反应，从而导致多脏器功能不全甚至死亡，目前尚无特效的治疗手段。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）是维持蛋白乙酰化状态的关键酶，参与免疫细胞（巨噬细胞）的激活、促炎及抗炎信号的转导。HDAC抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）能使过度炎症反应导致的乙酰化失衡状态重新恢复平衡。HDACI根据所抑制的HDAC特异性分为非选择性HDACI［pan-HDACI，包括丙戊酸（valproic acid，VPA），抑制Ⅰ、Ⅱa类HDAC］与选择性的HDACI（iso-HDACI，包括Apicidin抑制Ⅰ类HDAC MC1568、抑制Ⅱa类HDAC）。有关动物实验研究［1-3］表明，二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）、曲古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）及VPA等pan-HDACI可减轻LPS诱导的炎症反应，抑制巨噬细胞IL-1β、IL-6及TNF-α等基因和蛋白的表达［1，4］，但是目前尚不清楚pan-HDACI是通过抑制哪种HDAC亚型发挥抗炎效应的。我们前期研究［5］发现，SAHA抑制PQ诱导的巨噬细胞产生ROS、TNF-α，但是尚不清楚VPA的效应机制。

巨噬细胞是炎症反应的主要调节者。根据其活化方式及活化后功能，可分成2种不同的功能表型，即促炎（M1）型和抑炎（M2）型。M1和M2型巨噬细胞处于一个动态平衡的状态中。当过度炎症反应时，M1型巨噬细胞为主导，大量释放炎性细胞因子，最终导致组织损伤。巨噬细胞功能表型标志物有CD16/32、iNOS、IL-6、CD86、TGF-β1、ARG1、CD206和IL-10等，其中前4种属于M1型标志物，后4种属于M2表型标志物［6-8］，它们的表达情况决定了巨噬细胞的功能是促炎型还是抑炎型。本研究以小鼠巨噬细胞为研究对象，分析VPA分别对PQ和LPS诱导的巨噬细胞功能表型的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理

小鼠巨噬细胞RAW264.7（ATCC公司）培养条件如下：含10%胎牛血清（美国Invitrogen公司）的细胞培养液、37℃、5%CO2的孵箱。待细胞生长达80%左右的接触率时，吸出上清，更换为含0.5%胎牛血清细胞培养液。次日分组，分别给予以下处理：（1）PQ（0.1 mmol/L）；（2）PQ（0.1 mmol/L）+VPA（HDACⅠ和Ⅱa类，3 mmol/L）；（3）PQ（0.1 mmol/L）+ Apicidin（HDACⅠ类抑制剂，0.01 μmol/L）；（4）PQ（0.1 mmol/L）+MC1568（HDACⅡa类抑制剂，10 μmol/L）；（5）LPS（1 μg/mL）；（6）LPS（1 μg/mL）+ VPA（3 mmol/L）；（7）LPS（1 μg/mL）+Apicidin（0.01 μmol/L）；（8）LPS（1 μg/mL）+MC1568（10 μmol/L）。于8 h后收集各组细胞上清及细胞团进行检测。

1.2 RT-PCR检测

将上述收集的细胞团用RNeasy Mini试剂盒（德国Qiagen公司）提取总RNA，用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒（美国Applied Biosystems公司）反转录得到cDNA，具体操作按各试剂盒说明书，加入荧光定量PCR试剂SYBR Green Master Mix（瑞士Roche公司）、GADPH及上下游引物（上海生物工程股份有限公司）进行PCR扩增，引物序列：GAPDH上游5’-CCTGGAGAAACCTG CCAAGTAT-3’，下游5’-CTCGGCCGCCTGCTT-3’；CD16上游5’-CATCAGCTCCTGTCTGGTTT-3’，下游5’-CTCTCTGCAGCCTGTGTATTT-3’；iNOS上游5’-GAACGGAGAACGTTGGATTTG-3’，下游5’-TCAG GTCACTTTGGTAGGATTT-3’；CD206上游5’-GTG GTCCTCCTGATTGTGATAG-3’，下游5’-CACTTGT TCCTGGACTCAGATTA-3’；ARG-1上游5’-GTCCCT AATGACAGCTCCTTTC-3’，下游5’-CCACACTGAC TCTTCCATTCTT-3’。运用Roche LightCycler480检测，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对含量。

1.3 ELISA检测

留取各组细胞上清，用ELISA试剂盒（美国R&D公司）检测细胞上清中IL-10蛋白和TNF-α蛋白的含量，按试剂盒说明书步骤进行，用酶标仪（TECAN F200PRO，法国CISBIO公司）检测。

1.4 流式细胞检测

收集各组细胞团，用BD FACSCalibur流式细胞仪进行流式荧光蛋白检测（NOS2蛋白和ARG-1蛋白）。检测抗体为抗小鼠NOS2-APC抗体（美国eBioscience公司）及抗小鼠ARG-1 FITC抗体（美国R&D公司）。

1.5 统计学分析

应用EXCEL软件录入数据。每个指标重复检测3次，计量资料以x±s表示，组间比较采用两个独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PQ和LPS分别对巨噬细胞功能表型的作用

如表1所示，与对照组相比，PQ升高全部4个巨噬细胞M1型标志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和2个M2型标志物（CD206mRNA及ARG-1蛋白）水平，可见PQ以升高M1型标志物水平为主；与此相似，LPS也升高全部4个巨噬细胞M1型标志物（CD16mRNA、iNOS mRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和2个M2型标志物（IL-10蛋白及ARG-1蛋白）水平，可见LPS也是以升高M1型标志物为主。PQ与LPS的效应均是促进巨噬细胞向促炎表型极化，进一步分析可见，PQ与LPS的效应还略有不同：PQ升高M2型标志物中CD206mRNA水平，而LPS则升高M2型标志物中IL-10蛋白水平。

表1 PQ和LPS分别对巨噬细胞功能表型的作用（Tab.1 Effect of PQ and LPS on macrophage phenotype

1）P＜0.05 vs control（PQ）group；2）P＜0.05 vs control（LPS）group.

ItemControl（PQ）groupControl（LPS）groupPQ groupLPS group M1 maker CD16mRNA1.00±0.001.00±0.003.62±1.051）1.34±0.102）iNOSmRNA1.00±0.001.00±0.0015.74±1.631）2.12±0.192）TNF-α protein2 850.89±146.468 589.56±367.124 746.22±155.161）25 058.89±993.422）NOS2 protein46.76±5.7137.27±1.0556.53±2.851）79.40±5.012）M2 maker CD206mRNA1.00±0.001.00±0.003.08±0.791）1.91±0.54 ARG-1mRNA1.00±0.001.00±0.004.83±1.600.96±0.17 IL-10 protein57.40±5.43125.47±2.2655.23±3.38336.70±7.252）ARG-1 protein0.37±0.031.69±0.184.82±0.241）23.33±0.322）

2.2 VPA、Apicidin和MC1568分别对PQ作用的巨噬细胞功能表型作用的影响

如表2所示，与PQ作用的巨噬细胞相比，VPA降低2个M1型标志物（iNOS mRNA及TNF-α蛋白）和1个M2型标志物（IL-10蛋白）水平，可见VPA抑制PQ作用的巨噬细胞向促炎表型极化。Apicidin降低PQ作用的巨噬细胞3个M1型标志物（CD16 mRNA、iNOSmRNA及TNF-α蛋白）和1个M2型标志物（ARG-1mRNA）水平，其总体效应相当于降低了2个M1型标志物，同时Apicidin还升高1个M2型标志物（ARG-1蛋白）水平，由此可见Apicidin强于VPA的效应。MC1568降低PQ作用的巨噬细胞3个M1型标志物（CD16mRNA、iNOSmRNA及TNF-α蛋白）和3个M2型标志物（CD206mRNA、ARG-1 mRNA及ARG-1蛋白）水平，可见MC1568对PQ作用的巨噬细胞表型极化的作用不明显。因此，三者的效应强弱关系为：Apicidin＞VPA＞MC1568。

表2 VPA、Apicidin和MC1568分别对PQ作用的巨噬细胞功能表型的作用Tab.2 Effect of VPA，apicidin，and MC1568 on macrophage phenotype induced by PQ

1）P＜0.05 vs PQ group.

ItemPQ groupPQ+VPA groupPQ+Apicidin groupPQ+MC1568 group M1 makers CD16mRNA3.62±1.054.67±1.370.77±0.051）0.70±0.051）iNOSmRNA15.74±1.630.84±0.271）0.29±0.021）0.92±0.521）TNF-α protein4 746.22±155.16343.00±18.011）1 561.67±84.331）2 336.00±105.961）NOS2 protein56.53±2.8553.53±4.7348.57±4.8551.98±6.44 M2 makers CD206mRNA3.08±0.792.30±0.531.69±0.210.46±0.091）ARG-1mRNA4.83±1.601.43±0.340.45±0.081）0.83±0.061）IL-10 protein55.23±3.3841.70±1.141）64.00±5.9166.98±15.68 ARG-1 protein4.82±0.243.47±0.848.57±0.431）2.28±0.611）

2.3 VPA、Apicidin和MC1568分别对LPS作用的巨噬细胞功能表型作用的影响

如表3所示，VPA降低LPS作用的巨噬细胞4个M1型标志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和1个M2型标志物（ARG-1蛋白）水平，同时还升高1个M2型标志物（IL-10蛋白）水平，其总体效应相当于降低了4个M1型标志物，可见VPA抑制LPS作用的巨噬细胞向促炎表型极化。Apicidin降低LPS作用的巨噬细胞全部4个M1型标志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和2个M2型标志物（IL-10蛋白及ARG-1蛋白）水平，可见Apicidin抑制LPS作用的巨噬细胞向促炎表型极化有一定的作用，但是较VPA弱。MC1568降低LPS作用的巨噬细胞4个M1型标志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）水平，同时还升高2个M2型标志物（ARG-1蛋白及IL-10蛋白）水平，可见MC1568抑制LPS作用的巨噬细胞向促炎表型极化的作用比VPA更强。因此，三者的效应强弱关系为：MC1568＞VPA＞Apicidin。

表3 VPA、Apicidin和MC1568分别对LPS作用的巨噬细胞功能表型的作用（Tab.3 Effect of VPA，apicidin，and MC1568 on macrophage phenotype induced by LPS（

1）P＜0.05 vs LPS group.

ItemLPS groupLPS+VPA groupLPS+Apicidin groupLPS+MC1568 group M1 makers CD16mRNA1.34±0.100.57±0.221）0.62±0.241）0.51±0.131）iNOSmRNA2.12±0.190.3±0.051）1.4±0.171）0.57±0.121）TNF-α protein25 058.89±993.4221 271.31±640.791）7 927.11±177.721）19 388.73±557.421）NOS2 protein79.4±5.0166.97±2.061）56.37±2.241）55.4±4.991）M2 makers CD206mRNA1.91±0.540.73±0.122.55±0.740.92±0.07 ARG-1mRNA0.96±0.170.63±0.160.81±0.079.39±1.901）IL-10 protein336.70±7.25351.50±8.381）58.70±1.531）2 116.20±129.571）ARG-1 protein23.33±0.3212.09±4.071）11.86±1.411）18.77±7.35

3 讨论

3.1 PQ和LPS诱导的巨噬细胞促炎活性的异同点

本研究发现PQ和LPS对M1型表型标志物的作用是相似的，但对M2型标志物的作用不完全一致，提示PQ和LPS均具有促炎活性，但是具体作用机制可能有差异。当病原体感染宿主时，宿主通过Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、Nod样受体（Nodlike receptor，NLR）及RIG样受体（RIG-like receptor，RLR）等膜结合或跨膜模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），识别病原体的LPS等病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），激活胞内的炎症级联反应。当损伤作用于机体时，机体通过PRR识别损伤相关分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）启动炎症反应。PAMP和DAMP共享许多PRR，如TLR4和跨膜受体（TLR3、TLR7-9、NLR及RLR）等，提示感染和损伤诱导的炎症反应存在相似之处［9］。本研究发现的PQ和LPS均可诱导炎症反应这一现象验证了上述理论。

3.2 VPA主要通过抑制HDACⅠ类抑制PQ诱导的巨噬细胞促炎活性

本研究发现Apicidin对PQ诱导巨噬细胞促炎活性的抑制效应强于VPA，而VPA强于MC1568，因此VPA的作用主要是通过抑制HDACⅠ类实现的。KOCHANEK等［10］发现VPA减轻出血性休克动物肺组织炎症反应，HU等［11］发现VPA改善烧伤性休克动物的生存率，减少促炎因子水平。而SILLESEN等［12］在创伤患者的研究中发现HDACⅠ类（HDAC1、HDAC3）水平的升高与不良预后相关，CURTIS等［13］在鼠烧伤模型的研究中发现HDACⅠ类（HDAC1）水平的升高与烧伤后肺炎相关，可见HDACⅠ类与损伤导致的过度炎症反应相关。本研究也提示抑制HDACⅠ类减少PQ诱导的巨噬细胞促炎活性。

3.3 VPA主要是通过抑制HDACⅡa类来抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎活性

本研究发现VPA和MC1568抑制LPS诱导巨噬细胞促炎活性的作用均强于Apicidin，提示VPA的作用主要是通过抑制HDACⅡa类实现的。有研究［14］表明VPA调节TLR受体介导的免疫反应，减少脓毒症大鼠模型中组织损伤的标志物、TNF-α、MPO［3，15］，也有研究发现VPA抑制LPS作用巨噬细胞炎症反应。本研究首次提出VPA对脓毒症的治疗作用可能是通过抑制HDACⅡa类发挥的。

综上所述，本研究提示VPA不仅能抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎活性，还能抑制PQ诱导的促炎活性，但是对二者的作用机制略有不同，可能是通过不同的HDAC亚型发挥的作用。进一步在动物模型中验证VPA的治疗作用及机制，可能为探索新的急性PQ中毒和脓毒症治疗策略提供理论基础。

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（编辑武玉欣）

The Effects of Valproic Acid on Macrophage Polarization Induced by Paraquat or Lipopolysaccharide

ZENG Renqing1，WU Xizi1，ZHAO Yangzi1，DENG Yunlei2，YU Shiyuan3，LI Huiyi1，LIU Chang1，FAN Chenling4，WANG Hong4，CHONG Wei1

（1.Department of Emergency Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001 China；2.Department of Nephrology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001 China；3.Department of Neurosurgery，Sun Yat-Sen University Cancer Center，Guangzhou 510080，China；4.Department of Endocrinology and Metabolism，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To analyze the effects of valproic acid（VPA），a histone deacetylase（HDAC）inhibitor，on macrophage polarization induced by paraquat（PQ）or lipopolysaccharide（LPS）.MethodsMouse RAW264.7 cells were cultured at 37℃with 5%CO2，passaged，and then given one of the following treatments:（1）PQ；（2）PQ+VPA（classⅠandⅡa HDAC inhibitor）；（3）PQ+apicidin（classⅠHDAC inhibitor）；（4）PQ+MC1568（classⅡa HDAC inhibitor）；（5）LPS；（6）LPS+VPA；（7）LPS+apicidin；（8）LPS+MC1568.The cells and culture supernatants were harvested after 8 h of treatment.RT-PCR，ELISA，and flow cytometry were conducted to assess the expression levels of macrophage phenotypic markers.ResultsBoth PQ and LPS skewed the macrophage functional polarity toward proinflammatory phenotype.VPA，apicidin，and MC1568 all inhibited PQ-and LPS-induced macrophages polarizing toward pro-inflammatory phenotype，but the inhibitory effects were different in some ways.ConclusionVPA inhibits the proinflammatory function of macrophages induced by PQ and LPS，but the effect of VPA on PQ-and LPS-induced macrophages has its own characteristics.

paraquat；lipopolysaccharide；valproic acid；macrophage；phenotypic polarization

R459.7

0258-4646（2017）06-0548-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.016

国家自然科学基金（81372970）

曾仁庆（1989-），女，硕士研究生.

崇巍，E-mail：chongweixiena@126.com.

2016-09-23

网络出版时间：