表面增强拉曼光谱法快速测定干果类食品中的糖精钠

陈正毅，卢雅琳，梁 豫，曾 晨，张卓旻，李攻科

(中山大学 化学学院，广东 广州 510275)

表面增强拉曼光谱法快速测定干果类食品中的糖精钠

陈正毅，卢雅琳，梁 豫，曾 晨，张卓旻*，李攻科*

(中山大学 化学学院，广东 广州 510275)

建立了干果中糖精钠的表面增强拉曼光谱(SERS)快速分析方法。干果样品经水提取、C18固相萃取柱净化除杂后进行表面增强拉曼光谱分析。该方法的线性范围为 50.0～250 mg/L，检出限为 0.6 g/kg，回收率为80.0%～125%，相对标准偏差(RSD，n=5)不大于8.4% 。结果表明该方法灵敏度高、杂质干扰小、准确度高，满足干果类食品中糖精钠的快速检测要求，在干果类食品安全质量监控方面具有良好的应用潜力。

表面增强拉曼光谱法；快速分析；糖精钠；干果

糖精钠俗称甜精、糖精，是一种常见的人工合成甜味剂。由于糖精钠的甜度比蔗糖、红糖等天然甜味剂甜300～600倍[1]，被广泛添加于各类干果类食品。相关研究表明，糖精钠具有潜在的致癌效应[2-3]，影响未成年人健康[1-2]，因此许多国家对干果类食品中糖精钠的用量有严格规定，如欧盟对其限量为0.5～3.0 g/kg[4]，中国国标(GB 2760-2014)对其限量为1.0～5.0 g/kg[5]。目前，为了获得更好的口感和消费者认可度，许多市售干果类产品经常被过量添加糖精钠，因此干果类产品中糖精钠含量的快速分析对干果类产品质量监控具有重要意义。

目前，糖精钠的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[5]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[6]、薄层色谱法[7]、紫外分光光度法[8]、比色法[9]、电化学法[10]、酶联免疫法[11]等。其中，HPLC法是国家标准(GB/T 5009.28-2003)采用的分析方法[12]，但操作复杂、分析耗时长，不利于大量样品的现场快速检测。酚磺钛比色法和紫外分光光度法曾是糖精钠的快速筛查国标方法[13]，但因其样品提取和分离过程复杂，易受食品基体成分干扰，而最终被HPLC法取代。因此，目前尚无准确有效的干果类产品中糖精钠的现场快速分析方法。

表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)具有快速、灵敏及指纹特征分析等特点，由于便携SERS仪器尺寸小，非常适合于现场快速分析，现已广泛用于食品添加剂[14]、着色剂[15]和抗生素[16]等的快速分析。但实际样品基体复杂，严重影响了SERS定性定量分析的准确性，而将适当的样品前处理方法与SERS分析结合，能有效提高SERS分析的准确性。田中群课题组[17]研发出的壳层隔绝纳米粒子(Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy，SHINERS)避免了基体或者目标物与Au产生的电化学作用，获得了准确的待测物SERS光谱，提高了SERS定性的准确度[18]，已应用于食物中农药残留[19]、添加剂[20]等的检测。李攻科课题组[21]建立了一种固相萃取/SERS快速检测牛奶中三聚氰胺的方法，有效去除了牛奶基体干扰，检出限达0.1 mg/kg，回收率达75.3%～125%。本文旨在建立一种适用于干果类食品中糖精钠快速分析的SERS方法。通过优化超声提取、离心时间、固相萃取及SERS分析条件，消除基体干扰，最终实现了干果中糖精钠的SERS快速分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Delta Nu Inspector便携式拉曼光谱仪(美国Delta Nu)；TG16-WS台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；MIULAB微型离心机(杭州米欧仪器有限公司)。

高级纯糖精钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；SERS增强试剂CP-2(SHINERS，厦门市普识纳米科技有限公司)；盐酸(分析纯，广州化学试剂厂)；活性碳粉、氧化铝(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；硅胶(分析纯，烟台黄务硅胶开发试验厂)；十八烷基硅烷键合硅胶(C18，上海博势生物科技有限公司)；无花果、话梅等样品购自广州市当地超市。

糖精钠标准溶液的配制：用超纯水配制浓度为5 000 mg/L 的糖精钠标准储备液，将储备液逐级稀释成50.0，100，150，200，250 mg/L 的系列浓度标准溶液。

1.2 样品测定

将无花果、话梅、橄榄干样品剪碎并捣匀，称取2.0 g 样品，加入10.0 mL水，300 W下超声提取10 min，8 000 r/min离心5 min；将100 μL上清液转移至含有0.10 g C18的固相小柱中，加2.0 mL水，接收滤液，待测。移取200 μL SERS增强试剂CP-2于拉曼管中，加入100 μL待测液和10 μL 1.2 mol/L盐酸溶液，混匀后进行SERS检测。SERS条件：积分时间为20 s，测定次数为3，每次测试扣除暗电流背景1次，激光功率为High，结果为Average，分辨率为Low。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 提取条件 采用超声提取样品中的糖精钠，优化了超声时间和离心时间，实现了干果中糖精钠的快速提取，结果如图1A所示。在300 W超声功率下，对比了超声时间分别为4，6，8，10，12，14，16 min时的提取结果，结果表明，提取时间为12 min时目标峰的SERS信号开始稳定。在8 000 r/min离心条件下，对比离心时间分别为1，3，5，7，9 min时的提取结果，结果表明，离心5 min时目标峰的SERS响应最强。离心时间过短导致杂质沉淀不完全，影响后续SERS测定，所以提取阶段超声时间设为12 min，离心时间设为5 min。

2.1.2 固相萃取条件 由于糖精钠既包含疏水的苯环结构，又包含亲水的磺胺结构，不同萃取剂的吸附性能对糖精钠的分离富集效果不同。实验分别考察了活性碳、硅胶、氧化铝、C18作为固相萃取吸附剂对糖精钠分离富集效果的影响。结果表明，活性碳、C18对糖精钠的分离富集效果良好，但活性碳吸附的糖精钠难以洗脱，硅胶、氧化铝吸附剂易产生穿透现象，因此实验采用C18作为吸附剂。实验考察了不同C18吸附剂用量(0.02，0.05，0.10 g)对糖精钠SERS检测信号的影响，结果表明采用0.10 g C18吸附剂时，糖精钠的SERS信号最强。实验还考察了不同洗脱液体积(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL)对糖精钠洗脱效果的影响，结果如图1B所示，当洗脱液体积2.0 mL时可将糖精钠完全洗出。

2.2 SERS分析条件的优化

2.2.1 盐酸用量 向待测溶液中添加盐酸，可使SHINERS粒子表面带正电，从而改善SHINERS粒子对糖精钠的吸附选择性，有效提高方法的灵敏度。实验对比了盐酸加入量为2，4，6，8，10，12，14，16 μL 的SERS信号，结果如图1C所示。当HCl用量少于10 μL时，随着HCl 加入量的增加，SERS信号增强，HCl用量为10 μL时峰信号最强；继续加入HCl，SERS信号反而减弱。这可能是因为过多的盐酸导致带负电的糖精离子与H+结合，形成分子态的糖精，带正电荷SHINERS对其吸附量降低，从而导致SERS信号减弱。糖精钠在～710 cm-1处有明显SERS响应，且峰强度随浓度的增加而增大，是由SHINERS粒子与糖精钠中带负电的氨基连接所形成的磺胺环结构的呼吸振动引起[22-23]，这也证实了H+可以促进SHINERS对糖精钠的吸附选择性，提高SERS响应。因此，最终选择HCl的加入量为 10 μL。

2.2.2 SHINERS粒子与样品体积比的优化 为获得最佳SERS信号，优化了SHINERS粒子与样品溶液体积比。在总加入体积保持一致条件下，考察了SHINERS粒子与样品溶液的体积比分别为1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1时糖精钠的SERS特征峰响应，结果如图1D所示。随着体积比的增加，SERS响应逐渐增加，当比例为2∶1时SERS响应最强，继续增加体积比反而使SERS响应降低。这是因为SHINERS粒子过少时，导致提供的热点少而使得SERS响应弱，而SHINERS粒子过多时，由于热点过剩导致SERS的响应减弱。因此，最终选择SHINERS粒子与样品溶液的体积比为2∶1。

图2 糖精钠标准溶液的SERS谱图Fig.2 SERS spectra of saccharin sodium salt standard solution spectra(a-e) refer to standard solutions with concentrations of 50.0,100,150,200,250 mg/L，respectively； insert:calibration curve

图3 实际样品中糖精钠的SERS图谱Fig.3 SERS spectra of saccharin sodium salt in real samples spectra(a-d) refer to plum candy,Chinese olive,Ficus carica and 250 mg/L of standard solutions,respectively

2.3 方法选择性的研究

通过考察干果类食品中杂质对糖精钠SERS分析的干扰，研究了方法的选择性。以～710 cm-1峰强度变化为评价标准，若加入干扰物后峰强无明显变化，则视为不干扰。实验考察了干果类食品中的主要基体物质(包括蔗糖、苯甲酸钠、山梨酸钾、NaCl、维生素C等)对糖精钠SERS分析的干扰影响。其中，最大的干扰来自于防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾，因为其电离出的酸根可以吸附在SHINERS粒子表面，从而影响糖精钠的SERS测定。但苯甲酸钠(pKa=4.2)和山梨酸钾(pKa=4.8)[24]与H+的结合能力比糖精钠(pKa=2.1)[25]强，说明在优化的酸度条件下(pH=3.0，实测)，糖精负离子的分布系数比苯甲酸根和山梨酸根大，故大部分糖精负离子可以吸附在带正电的SHINERS粒子表面，可能存在的杂质对糖精钠的测定影响可以忽略。此外，同一酸度条件下，由于分子态的苯甲酸和山梨酸在溶液中的分布系数比分子态的糖精大，所以大部分苯甲酸和山梨酸被C18吸附，从而可排除杂质干扰。实验结果显示，当蔗糖、苯甲酸钠、山梨酸钾、NaCl、维生素C浓度为糖精钠浓度的50倍时，糖精钠的SERS谱图中710 cm-1处的特征峰面积无明显变化，表明干果食品基体物质不干扰糖精钠的SERS分析，方法的选择性满足实际样品分析要求。

2.4 SERS 快速分析方法的建立

配制浓度分别为 50.0，100，150，200，250 mg/L的系列糖精钠标准溶液，在优化条件下以～710 cm-1处特征峰峰面积(Y)对应标准溶液浓度(X,mg/L)绘制标准曲线(见图2)。结果表明，糖精钠在50.0～250 mg/L浓度范围内具有良好的线性关系，方法的工作曲线为Y=51.3X+179.1(r2=0.987 9)，相对标准偏差(RSD)为6.5%，检出限(S/N=3)为0.6 g/kg，定量下限(S/N=10)为2 g/kg。方法的灵敏度满足国标方法(GB 2760-2014)中干果类食品中糖精钠限量(5 g/kg)的检测要求。

2.5 实际样品分析

将该方法用于随机购买的3种干果类食品(无花果、话梅、橄榄干)中糖精钠的快速分析，结果表明无花果、话梅、橄榄干中的糖精钠均可定量检出(图3)，其含量分别为3.1,1.5,2.2 g/kg(表1)。3种实际样品均作加标回收实验，分别取5份平行样，加标量均为1.0,2.0,4.0 g/kg。加标回收实验结果表明方法的回收率为80.0%～125%，RSD(n=5)为1.3%～9.3%，与HPLC标准方法获得的结果比值在0.85～1.12之间，表明该方法准确可靠，可满足干果类食品中糖精钠的快速分析要求。

表1 实际样品分析及加标回收实验结果Table 1 Rapid analysis of saccharin sodium salt in real samples and recoveries from spiked experiments

*relative error referred to the difference of determination results achieved by SERS and HPLC

3 结 论

本文结合超声提取及固相萃取等前处理方法，建立了干果食品中糖精钠的SERS快速分析方法。系统优化了超声提取条件、固相萃取条件及SERS分析条件，有效消除了基体干扰，提高了方法的选择性和灵敏度。在优化实验条件下，该方法的线性范围为50.0～250 mg/L，检出限为0.6 g/kg，RSD(n=5)为6.5%。将该方法用于实际样品分析，检出无花果、话梅、橄榄干中的糖精钠含量分别为3.1，1.5，2.2 g/kg，回收率为80.0%～125%，与HPLC标准方法的相对偏差为-17%～10%，结果表明该方法准确可靠，可用于实际干果类食品中糖精钠的现场快速分析。

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Rapid Analysis of Saccharin Sodium Salt in Dried Fruits by Surface-enhanced Raman Scattering Spectroscopy

CHEN Zheng-yi,LU Ya-lin,LIANG Yu,ZENG Chen,ZHANG Zhuo-min*,LI Gong-ke*

(School of Chemistry,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China )

A rapid analytical method was developed for the determination of saccharin sodium salt in dry fruits by surface-enhanced Raman spectroscopy(SERS).The saccharin in real samples was extracted with water, followed being separated and cleaned up on the activated C18solid phase extraction column before surface-enhanced Raman scattering measurement.The linear range of this method was from 50.0 mg/L to 250 mg/L,and the detection limit was 0.6 g/kg.The good recoveries were in range of 80.0%-125% with relative standard deviations(RSD,n=5) no more than 8.4%.The results suggested that this method, with good anti-interference capability, was sensitive and reliable in the rapid determinattion of saccharin sodium salt in dry fruits.It is expected that this SERS based rapid analytical method possesses a great potential in monitoring the quality of dry fruits.

SERS；rapid analysis；saccharin sodium salt；dry fruits

2016-12-12；

2017-01-20

国家自然科学基金(21275168，21475154，21475153)；国家重大科学仪器设备开发专项(2011YQ0301240901)；广东省自然科学基金(2015A030311020)；广东省公益研究与能力建设专项(2015A030401036)；广州市民生科技重大专项(201604020165)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.012

O657.37；O629.1

A

1004-4957(2017)05-0650-05

*通讯作者：张卓旻，博士，副教授，研究方向：食品安全分析，Tel：020-84110922，E-mail：zzm@mail.sysu.edu.cn 李攻科,博士，教授，研究方向：色谱光谱分析、复杂体系分离分析，Tel：020-84110922，E-mail：cesgkl@mail.sysu.edu.cn