秀珍菇富硒多糖的制备及体外抗氧化活性研究

2017-06-07刘倩吴悦方明梦支小芳徐小青孙玉军

长江大学学报(自科版) 2017年10期

关键词：珍菇光密度亚硝酸盐

刘倩，吴悦，方明梦支小芳，徐小青，孙玉军

( 安徽科技学院生命科学学院，安徽凤阳233100)

秀珍菇富硒多糖的制备及体外抗氧化活性研究

刘倩，吴悦，方明梦支小芳，徐小青，孙玉军

( 安徽科技学院生命科学学院，安徽凤阳233100)

经液体富硒发酵培养秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)硒菌丝体，以此为原料制备富硒多糖(SPMP)，通过对羟基自由基、DPPH自由基、亚硝酸盐的清除作用及还原力的测定，研究SPMP的体外抗氧化活性。结果表明，SPMP具有一定的清除羟基自由基、DPPH自由基、亚硝酸盐能力和较强的还原能力，且与多糖的浓度呈明显的量效关系，其清除效果和还原能力均比秀珍菇多糖(PMP)高。由此可见，SPMP具有一定的体外抗氧化活性。

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)；富硒；多糖；抗氧化

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)属于担子菌纲伞菌目侧耳科侧耳属，是一种味道鲜美的食用真菌[1]。秀珍菇营养成分丰富，富含蛋白质、粗脂肪、多糖和多种维生素[2]。研究表明，秀珍菇多糖具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抑菌[5]、降血脂[6]等多方面的生物功能。

硒是机体生命活动必需的一种微量元素，是过氧化氢酶等氧化酶活性中心的组成成分，能够增强机体的抗氧化能力，抵抗有关疾病的发生。硒不能由机体自主合成，只能从体外摄取[7]。自然界的硒有无机硒和有机硒2种形式，与亚硒酸钠等无机硒相比较，硒多糖等有机硒毒性低、副作用小，易于被机体吸收和利用。同时，硒多糖兼有多糖和硒的活性，具有清除自由基、抗氧化、调节免疫等多种功能[8]。

真菌富硒发酵培养是将无机硒转化为有机硒的有效方法之一。采用添加亚硒酸钠进行秀珍菇富硒培养，经纱布过滤将硒菌丝体与发酵液分开，从硒菌丝体中提取制备秀珍菇富硒多糖，利用紫外光谱和红外光谱对其进行表征，并通过体外实验研究其抗氧化性，旨在为抗氧化药物和保健食品的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

秀珍菇菌种由安徽科技学院食用菌研究所提供；DPPH购自美国Sigma公司；亚硒酸钠、三氯乙酸、邻苯二胺、EDTA等均为分析纯。

主要仪器设备有：TDL5离心机(上海安亭科学仪器厂)、FA2004电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、R205B型旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)、FUS-50L发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司)、FD-1-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)、T6新世纪紫外分光光度计(北京普析通用仪器责任有限公司)、Nexus傅里叶红外光谱仪(美国NICOLET公司)、ZHWY-2102C往复式恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)、Multiskan Go全波长酶标仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 方法1.2.1 秀珍菇富硒发酵培养及富硒多糖SPMP的制备

将秀珍菇菌株接种于PDA培养基上，经活化、一级种子液、二级种子液培养，按10%的接种量接种于50L发酵罐中，并添加硒浓度为20μg/mL 的亚硒酸钠(依据最适硒浓度的单因素试验确定亚硒酸钠的添加量)，180r/min、25℃条件下发酵培养7d，纱布过滤除去发酵液，硒菌丝体经自来水多次淋洗，冷冻干燥，粉碎机粉碎，过100目筛。称取一定量的硒菌丝体粉末，按1∶20的料液比于70℃温水中浸泡3h，4800r/min离心15min，取上清液，浓缩，3倍体积95%的乙醇沉淀过夜，经乙醚、丙酮洗涤后溶于适当体积的蒸馏水中，冷冻干燥得秀珍菇富硒多糖SPMP(简称SPMP)。同时，以不加亚硒酸钠的培养基进行发酵培养，按相同的方法制备秀珍菇多糖PMP(简称PMP)作对照。

1.2.2 紫外可见光谱扫描

分别称取50mg SPMP、PMP于2个锥形瓶中，各加入5mL混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)于电炉上硝化至澄清，待冷却后转移至100mL容量瓶定容，再称取50mg亚硒酸钠溶解，定容到50mL容量瓶。分别吸取5mL溶液，加蒸馏水至25mL，再加入2mL 0.1%邻苯二胺溶液，用甲酸和氨水调pH 1.5～2.5，阴暗处静置50min。加甲苯10mL萃取，以不含样品的甲苯调零，在200～700nm波长范围内扫描。

1.2.3 红外光谱扫描

取SPMP、PMP各2mg，分别加入适量干燥的KBr粉末，混合均匀，在玛瑙研钵中研磨均匀后压片，于400～4000cm-1波数范围内进行红外光谱扫描。

1.2.4 SPMP多糖及其硒含量测定

SPMP多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[9]，SPMP硒含量测定采用邻苯二胺紫外分光光度法[10]，具体步骤如下：①硒标准曲线绘制。称取50mg亚硒酸钠定容至50mL得1mg/mL亚硒酸钠溶液，吸取10mL该亚硒酸钠溶液定容到100mL容量瓶得100μg/mL亚硒酸钠标准液。准确吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL亚硒酸钠标准液于三角瓶中，添加蒸馏水至25mL，加入2mL0.1%邻苯二胺溶液，用80%甲酸调pH至1.5～2.5，在阴暗处放置50min。加甲苯10mL用力振摇2min萃取，静置10min，吸取上层甲苯层，以不含样品的甲苯为对照，在334nm处测定光密度。以硒的浓度为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线。②样品硒含量测定。称取50mg SPMP于锥形瓶中，加入5mL混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)于电炉上加热硝化，硝化至溶液澄清，冷却，转移至100mL容量瓶中定容。吸取25mL于锥形瓶中，加2mL0.1%邻苯二胺溶液，用80%甲酸和浓氨水调pH 1.5～2.5，在阴暗处放置50min，加10mL甲苯萃取，测定光密度。

1.2.5 体外抗氧化活性测定

1)羟基自由基清除率依次加入2mL不同浓度的样品溶液、6mmol/L FeSO4溶液和6mmol/L 的H2O2溶液于各试管中，混匀，静置15min，再分别加入6mmol/L 的水杨酸溶液3mL，混匀，37℃水浴30min，于510nm波长处测定其光密度(D1)，以蒸馏水代替样品作为空白对照,测定其光密度(D0)，实验重复3次。羟基自由基的清除率公式[11]如下：

羟基自由基清除率=(D0-D1)/D0×100%

式中，D0表示空白对照的光密度；D1表示样品(SPMP、PMP)光密度。

2)DPPH自由基清除率依次加入不同浓度的样品溶液1mL、0.2mmol/L 的DPPH乙醇溶液3mL于各试管中，充分混匀，避光静置30min后，4000r/min离心10min，取上清于517nm波长处测定其光密度(D1)，以蒸馏水代替样品作为空白对照,测定其光密度(D0)，实验重复3次。DPPH自由基的清除率公式[12]如下：

DPPH自由基清除率=(D0-D1)/D0×100%

3)亚硝酸盐清除率依次加入不同浓度的样品溶液1mL、5μg/mL的NaNO22mL、蒸馏水1mL于各试管中，摇匀，室温静置10min，各管加入0.4 %对氨基苯磺酸1mL，摇匀，静置5min后，再加入0.2%的盐酸萘乙二胺1mL，摇匀，静置15min，于538nm处测定光密度(D1)。以蒸馏水代替样品作为空白对照,测定其光密度(D0)，实验重复3次。亚硝酸盐清除率公式[13]如下：

亚硝酸盐清除率=[(D0-D1)/D0]×100%

4)还原力依次加入不同浓度的样品溶液2mL、0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH=6.6) 2mL、1% K3[Fe(CN)6]溶液2mL于各试管中，混匀，于50℃恒温水浴锅中水浴20min，自来水冷却，再加入10%三氯乙酸溶液2mL，混匀，4000 r/min离心10min，取上清液2mL，再加入蒸馏水2mL和0.1%三氯化铁溶液1mL，混匀，常温10min后，于700nm处测定光密度[14]。光密度的大小反应其还原能力的大小，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 紫外光谱分析

图1 SPMP、PMP紫外扫描结果

图2 SPMP和PMP红外扫描结果

SPMP、PMP的紫外扫描结果如图1所示。由图1可知，亚硒酸钠在334nm处有很强的吸收峰，这与文献[15]报道相一致；硒多糖在334nm处也有吸收峰，而多糖在334nm处无吸收峰，由此说明通过添加亚硒酸钠进行富硒发酵培养，菌丝体富集了硒元素，以此为原料制备的多糖样品含有硒元素，即通过发酵培养将亚硒酸钠无机硒转化成有机硒多糖SPMP。

2.2 红外光谱分析

SPMP和PMP的红外扫描结果如图2所示。由图2可以看出，SPMP 的主要吸收峰有2998.7cm-1、2382.6cm-1、1568.1cm-1、1498.7cm-1、1389.6cm-1、1287.6cm-1、1215.4cm-1、 1194.1cm-1、1123.3cm-1、1063.8cm-1、888.2cm-1；PMP的主要吸收峰有2998.7cm-1、2391.1cm-1、1490.2cm-1、1389.6cm-1、1283.4cm-1、1219.6cm-1、1133.2cm-1、1061.0cm-1、895.2cm-1。两者红外表征相似，在2998.7cm-1处均有糖类的典型特征吸收峰，这是由糖类C-H伸缩振动引起的吸收。SPMP在1568.1cm-1，1194.1cm-1处有吸收峰，而PMP在此处无吸收峰，说明两者的结构存在一定差异，这主要是SPMP的一些官能团结合硒而引起吸收波长出现一定的偏移造成的[16]。

2.3 SPMP多糖含量及其硒含量

根据绘制葡聚糖标准曲线测得的数据，通过EXCEL得出多糖含量测定的回归方程为y=0.012x-0.001，R2=0.9991(式中：y为光密度值；x为多糖浓度)。根据绘制硒标准曲线测得的数据，通过EXCELL得出硒含量测定的回归方程为y=0.2276x+0.0395，R2=0.9903(式中：y为光密度值，x为硒浓度)。经计算，SPMP中多糖含量为60.81 %，有机硒的含量为8.65mg/g。

图3 SPMP及PMP对羟基自由基清除作用结果

图4 SPMP和PMP对DPPH自由基清除作用结果

2.4 SPMP对羟基自由基的清除效果

羟基自由基是一种对生物机体危害较大、毒性较强的自由基。药物对羟基自由基的清除能力是其抗氧化的重要指标之一。SPMP及PMP对羟基自由基清除作用的结果如图3所示。由图3可以看出，SPMP对羟基自由基具有一定的清除能力，且清除率随着浓度的升高而增大，与浓度存在一定的量效关系；SPMP对羟基自由基的清除率均大于同一浓度的PMP。

2.5 SPMP对DPPH自由基的清除效果

DPPH自由基是一种以氮为中心的自由基，对它的清除，可以表示受试物具有一定的清除羟基自由基、烷自由基的能力和打断脂质过氧化链反应的作用。SPMP和PMP对DPPH自由基清除作用结果如图4所示。由图4可以看出，秀珍菇富硒多糖具有一定的清除DPPH自由基能力；SPMP对DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而增大，与浓度存在一定的量效关系；SPMP对DPPH自由基的清除率均比同浓度的PMP高。

2.6 SPMP对亚硝酸盐的清除效果

图5 SPMP及PMP对亚硝酸盐清除作用结果

亚硝酸盐在酸性水溶液中能与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合反应生成红色化合物，红色化合物颜色的深浅反映溶液中亚硝酸盐浓度的高低。SPMP及PMP对亚硝酸盐清除作用结果如图5所示。由图5可以看出，SPMP对亚硝酸盐具有一定的清除作用，清除能力随着浓度的升高而增大，与浓度存在一定的量效关系；SPMP对亚硝酸盐的清除率均比同浓度的PMP高。

2.7 SPMP的还原能力

抗氧化性物质通过自身的还原作用提供电子清除自由基，其还原能力的强弱反映受试物抗氧化能力的高低。SPMP和PMP的还原能力测定结果如图6所示。由图6可以看出，SPMP具有一定的还原能力，还原能力随着浓度的升高而增大，与浓度存在一定的量效关系；SPMP的还原能力均比同浓度的PMP高。

图6 SPMP和PMP的还原能力测定结果

3 结论

通过紫外可见光谱扫描、红外扫描对制备的秀珍菇多糖和硒多糖的结构表征进行分析，发现硒多糖和多糖的基本结构相似，其多糖含量为60.81%，硒含量为8.65mg/g。体外抗氧化实验表明，秀珍菇富硒多糖具有较强的还原能力；对羟基自由基、DPPH自由基和亚硝酸盐具有一定的清除能力。因此，秀珍菇富硒多糖作为天然的抗氧化药物值得进一步开发与应用，有关富硒多糖的化学组成、结构以及体外抗氧化的机理等有待进一步研究。

[1]Hibbett D S,Binder M,Bischoff J F,etal.A higher-level phylogenetic classification of the Fungi [J].Mycological Research,2007,111:509～547.

[2]孙玉军,江昌俊,祝嫦巍,等.秀珍菇多糖PMP-2a的理化性质及其体外抗氧化活性研究[J].现代食品科技,2014，(12):79～84.

[3]Wang Q,Li H,Chen T T,etal.Yield,polysaccharides content and antioxidant properties ofPleurotusabalonus,andPleurotusgeesteranus,produced on asparagus straw as substrate[J].Scientia Horticulturae,2012,134:222～226.

[4] Zhang M,Zhu L,Cui S W,etal.Fractionation,partial characterization and bioactivity of water-soluble polysaccharides and polysaccharide-protein complexes fromPleurotusgeesteranus.[J].International Journal of Biological Macromolecules,2011,48:5～12.

[5]申进文,王瑞瑞,许春平.秀珍菇多糖的硫酸化及其生物活性研究[J].河南农业科学,2014,43(7):102～106.

[6]Duobin M,Yuping M,Lujing G,etal.Fermentation characteristics in stirred-tank reactor of exopolysaccharides with hypolipidemic activity produced byPleurotusgeesteranus5#[J].Anais Da Academia Brasileira De Ciências,2013,85:1473～1481.

[7] Xu X M,Carlson B A，Grimm T A,el al.Rhesus monkey simian immunodeficiency virus infection as a model for assessing the role of selenium in AIDS [J].Acquired Immune Defic Syndr,2006,31:453～463.

[8] Staaf M,Yang Z N,Huttunen E,etal.Structural elucidation of the viscous exopolysaccharide produced by lactobacillus LB161 [J].Carbohydrate Research,2000,32:113～119.

[9]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社,1999.

[10] Hu D,Liu Q,Cui H,etal.Effects of amino acids from selenium-rich silkworm pupas on human hepatoma cells[J].Life Sciences,2005,77:2098～2110.

[11]张俊生,陈莉华,朱士龙,等.节节草多糖的体外抗氧化活性[J].食品科学,2013,34(5):86～89.

[12]严春艳,华雨蕾,黎乃生,等.薄树芝多糖提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].中药材,2013,36(5):825～827.

[13]张强,王松华,孙玉军,等.洋葱中黄酮类化合物体外抗氧化活性研究[J].农业机械学报,2009,40(8):139～142.

[14]张泽庆,田应娟,张静.防风多糖的抗氧化活性研究[J].中药材,2008,31(2):268～272.

[15]冯波,赵红卫,傅春蓉,等.微波消解-紫外分光法测定富硒沼泽红假单胞菌中的硒含量[J].四川大学学报(自然科学版),2012,49(2):417～421.

[16]高义霞,袁毅君,周向军,等.罗望子多糖硒酸酯的制备及表征[J].药物分析杂志,2012，(7):1222～1226.

[编辑] 李启栋

2016-12-15

安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2014A052)；安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2016221)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201610879009)。

刘倩(1997-)，女，现从事多糖研究。通信作者：孙玉军，sunyujun208@163.com。