解磷解钾根际促生菌的分离鉴定和筛选应用

宋凤鸣，刘建华，史正军，江亚雄，叶宇轩，许建新

（1.深圳市铁汉生态环境股份有限公司，广东 深圳 518008；2. 深圳市中国科学院仙湖植物园/深圳市南亚热带植物多样性重点实验室，广东 深圳 518004）

解磷解钾根际促生菌的分离鉴定和筛选应用

宋凤鸣1，刘建华1，史正军2，江亚雄1，叶宇轩1，许建新1

（1.深圳市铁汉生态环境股份有限公司，广东 深圳 518008；2. 深圳市中国科学院仙湖植物园/深圳市南亚热带植物多样性重点实验室，广东 深圳 518004）

为了获得具有高效解磷解钾能力、适宜作为菌肥生产菌的根际促生菌，采用选择性培养基，以稀释培养法针对性地筛选具有解无机磷、解钾能力的根际促生菌，通过生理生化实验结合16S rDNA序列分析对分离菌株进行鉴定，并比较其解磷解钾效果，筛选出无拮抗的菌株并发酵菌液作为菌肥应用。结果表明：多个细菌菌株中，b6巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）解无机磷活性较强，b7胶质芽孢杆菌（Bacillus mucitaginosus）解钾活性较强。复合菌肥在实验室盆栽条件下对山毛豆（Tephrosia candida）促生效果显著，但其肥效与化肥仍有差距，可搭配减量化肥施用，提高化肥利用率。

根际促生菌；解钾；解无机磷；鉴定；筛选

氮、磷、钾是植物生长发育必不可少的元素，植物的需要量巨大。施用氮磷钾化肥是我国农业中使用普遍且见效快的施肥方法，但据统计，我国化肥的有效利用率很低，氮肥平均利用率为30%～35%，磷肥为10%～20%，钾肥为35%～50%［1］。过度施肥会影响土壤结构，导致养分流失，引起部分地区土壤盐碱化、酸化、板结，水体富营养化，空气污染等，给生态环境带来很大的负面影响［2］。实际上，土壤中并不缺乏磷钾源，地壳中磷元素的平均含量大约为0.28%（以P2O5计），分为无机磷和有机磷，主要以钙、铁、铝等的磷酸盐为主［3］，溶解性差，难于被植物吸收。钾在地壳中的含量达2.59%，钾长石和云母等硅酸盐矿物占地球表面岩石和土壤的60%以上，而土壤中90%～98%的钾存在于以上硅酸盐矿物中，只有经过漫长的风化作用后才能转变为可被植物直接吸收利用的有效钾［4-5］。

植物根际促生菌（PGPR）是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类有益菌群，具有固氮、解磷、解钾及分泌植物激素等生理活性［6］。已有研究表明，解磷细菌可产生和释放有机酸，可降低植物根际土壤pH值，又能与Ca2+、Fe2+、Al3+等离子鳌合，使磷有效溶解，促进土壤中的无效磷有效化［7-8］。解钾细菌可通过有机酸、氨基酸、酶、生物膜、胞外聚合物、氧化还原作用和荚膜多糖络合作用等方式风化硅酸盐矿物，将矿物中不溶性的钾、铁、硅等元素转变为可溶性元素［9-12］。本研究从土壤中有针对性地筛选分离特定的根际促生菌，对分离菌株进行鉴定，并比较其解无机磷活性和解钾效果，筛选出无拮抗的菌株并发酵菌液作为菌肥应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从深圳梧桐山不同海拔及朝向的坡面选取猪屎豆、簕仔树等边坡植物小苗，用抖落法获得植物根际土壤，用无菌袋密封带回实验室分离。

培养基：（1） 细菌基础培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.4；（2）解钾细菌培养基：蔗糖5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO42 g，NaCl 0.1 g，CaCO30.1 g，高岭土5.0 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.5；（3）解钾发酵培养基：蔗糖5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO42 g，FeCl30.005 g，K2HPO40.2 g，CaCO30.1 g，钾长石5.0 g，pH 7.0～7.5；（4）解磷细菌培养基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g， MnSO4·4H2O 0.03 g，水1000 mL，琼脂20 g，pH 7.0～7.5；（5）解磷发酵培养基（NBRIP）：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，MgCl25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO40.1 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0～7.5。

供试矿物长石与高岭土纯度均在98%以上，长石中主要化学成分含量分别为SiO265.5%、Al2O318.5%、K2O 12.0%。

生物菌肥产品的制备：将各菌接种至解磷、解钾培养基中培养至稳定期，将各菌发酵液等体积混合，3 000 r/min离心5 min后收集沉淀菌体，加入体积相等的无菌水复溶，即为成品肥液。

1.2 菌株分离和鉴定

采用磷酸三钙为磷源的培养基分离解磷菌株，采用硅酸盐专性营养培养基作为解钾培养基分离解钾菌株。将3 g土样溶于50 mL无菌水充分振荡并梯度稀释成102、103、104倍土壤悬液，然后每个稀释度各取500 μL均匀涂布于培养基平板上，37℃倒置培养。在解磷培养基上挑取具解磷圈的菌落，在解钾培养基上挑选无色、透明、油滴状并富有弹性的菌落，进一步纯化直至获得纯培养为止。最后将所获得的纯培养菌株转入终浓度为25%的甘油中并密封保存于冰箱。

对细菌进行革兰氏染色及相关生理生化实验（过氧化氢酶活性、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵试验、甲基红试验、V.P试验、淀粉水解试验、吲哚试验、明胶液化试验），根据细菌菌落的形态及生理生化实验将细菌初步鉴定到属［13］。采用细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）进行细菌DNA提取，对革兰氏阳性菌加溶菌酶处理后再进行DNA提取，用细菌通用引物27f，1492r，参照相关文献报道的方法扩增。经测序公司测序后用软件BioEdit7.01中的CLUSTAL W多序列比对程序进行序列比对，系统发育树由MEGA 5.0软件构建，方法为邻接法（Neighbor-Joining）。

1.3 根际细菌解磷解钾试验

将菌株分别接种于50 mL种子培养液中于37℃、180 r/min下扩大培养1 d，细菌培养进入稳定期，OD600值达到0.6后，作为种子液。用移液枪取1 mL种子液加入100 mL解无机磷细菌发酵培养液中，以不接任何菌液的发酵培养基为空白对照组，每个处理3次重复，于28℃、150 r/min下培养7 d。培养结束后，先测定菌液pH值，用稀释平板法测定活菌数，剩余发酵液 6000 r/min离心10 min，将上清液定容至50 mL容量瓶中，消煮后用钼磷比色法测定速效磷含量。

解钾实验中，发酵培养基选择1.2中的解钾发酵培养基。发酵液消煮后用火焰光度计测定钾离子含量，其余操作同上。

1.4 细菌拮抗试验

拮抗试验采用琼脂块法，将一种待试菌接种于涂布好的另一种待试菌的平板上，正放12 h后再倒置培养24 h，观察琼脂块周围有无抑菌圈产生。

1.5 菌肥应用试验

土壤灭菌后装入规格一致的花盆中，播种山毛豆种子于土中培养，种子发芽后疏苗至每盆3株。试验设施加肥液200 mL、施加肥液100 mL+史丹利1000倍水溶性复合肥100 mL、施加史丹利1000倍水溶性复合肥200 mL和空白对照（施加无菌水200 mL）4个处理，分别用A、B、C、CK表示。每个处理3次重复，每个重复3盆。每隔7 d追肥1次，定期观察各处理植株长势，测量株高、冠幅等生长量。

2 结果与分析

2.1 菌株分离和鉴定

2.1.1 菌株分离结果 用解磷培养基分离出8个菌株，解钾培养基仅分离出1个菌株b7。b7在硅酸盐培养基上（28℃，培养3 d）表现为无色透明隆起油滴状菌落，菌落表面光滑、粘稠、富有弹性，挑起时能拉成丝，其他菌株在硅酸盐培养基上则表现为较小的点状菌落。同时，b7还可以在解磷培养基上产生解磷圈。

革兰氏染色、芽孢染色和生化测定结果表明，7株供试细菌均为革兰氏阳性、可在好氧环境中产芽孢，芽孢中生或近中生、椭圆状或柱状，均应属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。b9为革兰氏阴性菌，无芽孢，细胞短杆状，大小约0. 6μm×1.2μm，菌落圆形、黄色、边缘整齐，初步鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。b8为革兰阴性粗短杆菌，宽0.6～1.1μm、长1.2～3.0μm，有周身鞭毛，无芽孢无荚膜。菌落特征：LB培养基、30℃培养，菌落白色、圆形、表面光滑、稍突起、边缘整齐、不透明，菌落粘在培养基表面。

2.1.2 菌株生理生化试验结果 各菌株中，b5、b7、b8、b9为革兰氏阴性菌，其余为革兰氏阳性菌各菌株生理生化试验结果见表1。

表1 筛选菌株生理生化试验结果

2.1.3 菌株分子鉴定结果 菌株b1～b7基于16S rDNA的进化树如图1所示，其中b1菌株与枯草芽孢杆菌B. subtilis KP876486.1、b5与地衣芽孢杆菌B. licheniformis FJ447354.1、b6与巨大芽孢杆菌B. megaterium DQ408589.1序列的同源性均达到100%。b7与胶质芽孢杆菌B. mucilaginosus HM579819.1、胶质类芽孢杆菌Paenibacillus mucilaginosus JF810846.1序列的同源性均达到99%。结合生理生化实验结果，将b1鉴定为枯草芽孢杆菌，b5鉴定为地衣芽孢杆菌，b6鉴定巨大芽孢杆菌，b7定为胶质芽孢杆菌。b2、b3、b4亲缘关系较近，与蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌16S rDNA序列同源性均为99%，根据16S rDNA序列和生理生化实验结果仍无法鉴定至种，根据进化树推测b2、b4为蜡状芽孢杆菌，b3为苏云金芽孢杆菌。

图1 菌株b1～b7基于16S rDNA的进化树

b8菌株与阴沟肠杆菌（KU051717.1）、产气肠杆菌序列同源性较高（99%），进化树显示其与阴沟肠杆菌聚在同一分支，亲缘关系可能更接近于阴沟肠杆菌，结合生理生化实验结果将b8定为阴沟肠杆菌（图2）。

b9菌株与荧光性假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）序列同源性较高，进化树与荧光性假单胞菌在同一分支，结合生理生化实验结果将b9鉴定为荧光性假单胞菌（图3）。

图2 菌株b8基于16sRNA的进化树

图3 细菌菌株b9基于16sRNA的进化树

2.2 解磷解钾活性比较

2.2.1 细菌解无机磷效果比较 各菌株均具有较明显的解无机磷效果，发酵培养结束后，各菌株发酵液速效磷含量较对照NBRIP溶液有了显著增加。速效磷含量最高的是b6巨大芽孢杆菌发酵液，达128.26（±2.26）μg/mL，解磷能力最强；其次是b8阴沟肠杆菌120.43（±1.65）μg/mL、b5地衣芽孢杆菌118.35（±0.89）μg/ mL、b7胶质芽孢杆菌114.35（±2.67）μg/mL、b9荧光性假单胞菌112.14（±1.10）μg/mL；其余菌株发酵液速效磷含量数值相差不大，但仍显著高于对照（表2）。

发酵结束后，各菌株发酵液pH值均有不同程度下降，表明菌株在发酵过程中均产生了有机酸类代谢物质。同时，菌株发酵液pH值越低，速效磷含量越高，即各菌株解磷能力与发酵液pH值下降值呈现出一定相关性，经相关性分析后得到回归方程y=46.048x+63.949，R2=0.5696，相关性达到显著水平。

表2 细菌的长石摇床发酵实验

2.2.2 细菌解钾效果比较 各菌株中解钾效果最显著的是b7胶质芽孢杆菌，发酵液速效钾浓度达105.15（±1.73）μg/mL，较对照提高18.56%，其次是b6巨大芽孢杆菌和b8阴沟肠杆菌，速效钾浓度较对照分别提高11.48%、10.09%，其余菌株发酵液速效钾浓度数值相差不大，但仍显著高于对照（表3）。

表3 细菌的长石摇床发酵实验

从各菌株发酵液速效钾比对照增加量与发酵液pH下降值的相关性分析得出，回归方程为y=37.031x-36.294，R2=0.5514，相关性达到显著水平，表明菌株解钾作用同样与有机酸的产生有关。

2.3 细菌拮抗试验

菌株拮抗试验结果表明，b8阴沟肠杆菌对芽孢杆菌和b9假单胞菌有轻微的相互拮抗，其他菌株间均没有相互拮抗。根据微生物肥料生物安全通用技术准则（NY1109-2006）规定，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的安全分级均为一级，为可免做毒理学试验的菌种，可直接用于生产。且以上几种芽孢杆菌相互间不存在拮抗现象，故将菌肥应用菌株确定为以上4种。

2.4 菌肥应用试验

如图4所示，4个处理中，对照生长情况最差，处理A的株高、冠幅等生长量均显著优于对照，表明菌肥对提高植物生长有显著促进作用。处理B、C的生长量又显著优于处理A，表明复合肥促进植物生长的效果更明显，全部施用菌肥肥效有限，处理B、C之间差异不显著，表明半量菌肥与半量化肥配合施用可发挥较好的肥效，与全量化肥施用效果没有显著差异。

图4 菌肥对山毛豆株高、冠幅生长量的促进作用

3 结论与讨论

试验筛选的解磷细菌分别属于芽孢杆菌属、肠杆菌属、假单胞菌属，这与多数研究报道［14-16］结果一致。据相关文献报道［7-8］，微生物解磷作用复杂，不同细菌种类其解磷能力不同，部分菌株解无机磷效果不强，但却具有显著的解有机磷作用；在解无机磷方面，相同菌株在不同难溶性磷酸盐为底物条件下的解磷能力也有差异，表明单一实验很难全面测定一个菌株的解磷能力。但在土壤中，无机磷约占总磷的60%～80%，磷酸盐中又以钙盐为主，因此细菌解磷酸三钙的能力可在一定程度上反映出细菌在土壤中解磷能力的强弱，筛选解磷酸三钙的能力较强的细菌用于菌肥生产更适合推广应用。

微生物解钾研究一般以硅酸盐细菌为主，胶质芽孢杆菌可在无钾源、无氮源的硅酸盐细菌培养基中生长，而其他菌株在该培养基上菌落则表现出生长不良，但发酵实验证明，所筛选的解磷菌株同时也具备一定的解钾能力，推测是由于菌株生长活动的氧化还原反应、所产生的代谢产物如有机酸等导致长石被一定程度风化，从而导致可溶性钾浓度升高。

土壤肥力由生物肥力、化学肥力、物理肥力3部分组成，使用微生物肥料可提高土壤的生物肥力，有利于土壤团粒结构的形成，间接提高物理肥力。但在实际生产中，菌肥往往存在应用效果不稳定、增产效果不明显等情况［6，8］。根据实验结果，试验菌株在实验条件下具有一定解磷解钾效果，在无菌土壤中可发挥较显著肥效，可促进植物生长。但在非实验条件下，菌肥效果的发挥与菌群对施用土壤微环境的适应性、菌株能否在植物根系较好定殖关系紧密。土壤中原有的土著微生物种类繁多、数量巨大，接种菌株需适应施用土壤微环境、与土著微生物竞争后方可成为优势菌群，故接种菌株在施用土壤中很难达到实验培养条件下的有效孢子浓度。因此，菌肥仅能产生有限的化学肥力，肥料有效性、速效性均不如化肥，用菌肥完全替换化肥不现实，这也是菌肥应用的常见误区之一。菌肥、化肥两者配合施用则可以提高肥料利用率、减少部分化肥的投入、节约生产成本，同时也有利于土壤的良性发展。

生产中施用农药或过量化肥、高温及过度曝晒等均可导致菌体死亡。为了促进根际促生菌在植物根系的定殖，应人为创造适宜促生菌生长的条件，如尽量使用生物农药替代化学农药、调节土壤酸碱度、增施有机肥、改良盐碱化土壤、提高土壤物理肥力等。研究表明，有机肥作为一种能提供多种无机养分和有机养分的肥料，本身就是植物废弃物堆肥发酵后形成的终产物，较适合作为微生物发酵载体，有机肥与菌肥复配可以提高菌肥的活菌保存率，未来兼具微生物肥效和有机肥效的生物有机肥推广应用的前景可能更佳［17］。对于生产中合理施用化肥、提高化肥利用率，有机肥、菌肥与化肥的最佳施用量及配比值得进一步深入研究。

本试验筛选的菌株中，胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、阴沟肠杆菌均有相对较显著的解磷解钾作用，且这几种菌兼具一定固氮作用，较适合应用于菌肥生产。目前前两种菌已有推广应用，而阴沟肠杆菌则仅见于研究报道和小面积推广应用，如水稻根际固氮、烤烟菌肥、有机磷生物降解等方面，但应避免与其拮抗菌菌肥同时施用，同时应做毒理学试验确认其生物安全性再进行推广应用，值得进一步深入研究。

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（责任编辑 杨贤智）

Identification and screening of plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR）with ability of phosphatesolubilizing or potassium-solubilizing

SONG Feng-ming1，LIU Jian-hua1，SHI Zheng-jun2，JIANG Ya-xiong1，YE Yu-xuan1，XU Jian-xin1
（1.Shenzhen Techand Ecology & Environment Company Limited in Guangdong Province， Shenzhen 518008，China；2. Fairylake Botanical Garden，Shenzhen & Chinese Academy of Sciences/Shenzhen Key Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity，Shenzhen 518004，China）

In order to obtain plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR） strains with efficient activity on solubilizing phosphate or potassium, and the potentiality as fertilizer-producing bacteria, strains were isolated by using selective medium and diluting culture, then they were identified after a series of physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis. And the solubilization activity was tested, unopposed strains were selected and used as biological bacterial fertilizer. The results showed that b6 （Bacillus megaterium） had efficient activity on solubilizing inorganic phosphorus, b7 （B. mucitaginosus） had efficient activity on solubilizing potassium. Under laboratory conditions, the compound biological fertilizer had a significant promoting effect on Tephrosia candida, but it still couldn’t replace chemical fertilizers. Biological bacterial fertilizer can be used with the reduction of chemical fertilizer, to improve the fertilizer utilization.

plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR）；potassium-solubilizing；inorganic phosphorussolubilizing；identification；screening and application

S144.9

A

1004-874X（2017）03-0094-07

2017-01-08

广东省科技计划项目（2014B090903015，2015B090904008）

宋凤鸣（1987-），女，硕士，助理工程师，E-mail：490257804@qq.com

许建新（1982-），男，博士，高级工程师，E-mail：582546461@qq.com

宋凤鸣，刘建华，史正军，等.解磷解钾根际促生菌的分离鉴定和筛选应用［J］.广东农业科学，2017，44（3）：94-100.