乙醇回流法提取苹果中绿原酸的工艺研究

杨 小 峰

(忻州师范学院生物系，山西 忻州 034000)

乙醇回流法提取苹果中绿原酸的工艺研究

杨 小 峰

(忻州师范学院生物系，山西 忻州 034000)

目的 绿原酸对机体有诸多益处，而苹果中含有绿原酸，实验旨在优化提取苹果中绿原酸的方案。方法 采用乙醇回流法提取苹果中的绿原酸，对其最佳提取工艺进行研究和分析。采用单因素设计实验和响应曲面的研究手段，对乙醇浓度、料液比以及提取时间3个条件进行探究及优化，在现有实验条件下，找到最优的绿原酸提取方案。结果 实验表明，乙醇浓度为67%、料液比为1：11、提取时间为1.87 h时，苹果中绿原酸的提取量达到最高值2.780 mg.g-1。结论 优化提取方案，可以从苹果中提取更多的绿原酸。

苹果；绿原酸；乙醇回流法；响应曲面法

苹果有“智慧果”、“记忆果”的美称，它可以调节肠胃功能，降低胆固醇、降血压、防癌、减肥，还可以增强儿童的记忆力。苹果不但含有多种维生素、脂质、矿物质、糖类等构成大脑所必需的营养成份，而且含有有利于儿童生长发育的细纤维和增强儿童记忆力的锌。锌是构成和记忆力息息相关的核酸与蛋白必不可少的元素，缺锌会使大脑皮层边缘部海马区发育不良[1]。

图1 绿原酸的结构式

绿原酸(chlorogenic acid)是植物在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径的中间产物合成的一种苯丙类物质，由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸。

绿原酸分子式：C16H18O9,分子量：345.30，其结构式如图1：

绿原酸有如下几个方面的作用：抗氧化、清除体内自由基、抗突变性、抗癌等。此外绿原酸具有抗艾滋病病毒(HIV)活性，对胃溃疡也有显著的抑制作用[2]。

目前，绿原酸的提取研究材料大多为金银花、杜仲叶等，还未见到关于苹果中绿原酸提取的研究。

1 主要仪器与试剂

仪器：水浴回流提取装置；电子天平(常州双杰电子有限公司)；GZX-9246 MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；LC-4016低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；紫外-可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

材料及试剂：苹果(红富士，产地山西忻州)；无水乙醇(郑州派尼化学试剂厂)；浓盐酸(郑州派尼化学试剂厂)。

2 实验方法

2.1 实验流程与步骤

苹果削皮去核切片→烘干→粉碎→称量→乙醇溶液→提取→离心→取上层清夜→紫外检测。

(1)将苹果削皮去核切成片，置于鼓风干燥箱中120 ℃烘干；

(2)粉碎，粉碎机粉碎至粉末(颗粒太大，提取器体积利用率不高不利于有效成分溶出)；

(3)随机称取5 g苹果粉于烧瓶中，加入10倍70%乙醇溶液，提取时间2 h；

(4)提取后，收集溶液于离心管中，放入离心机离心10 min；

(5)离心后,收集上清液，用0.2 mol.L-1盐酸稀释。在324 nm处测定吸光度，与标准曲线对照，定量。重复2次，取平均值。

(6)按下面公式[3]计算绿原酸的取得量:绿原酸的取得量(mg.g-1)=CV/M

(1)

式中：C：提取液中绿原酸的浓度(mg.mL-1)V:提取液的体积(mL)M:苹果粉质量(g)

表1 乙醇浓度对绿原酸提取量的影响

2.2 标准曲线

标准曲线采用y=0.0461x+0.0089，R=0.9987，其中y为吸光度，x为绿原酸对照品溶液浓度(μg.mL-1)，绿原酸浓度在0.004～0.022 mg.mL-1范围内呈现良好的线性关系[4]。

2.3 苹果中提取绿原酸的单因素实验

2.3.1 乙醇浓度

称取5份5.00 g苹果粉，置于烧瓶中，分别加入10倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇(V/W),80 ℃恒温水浴中回流提取2 h，离心，收集上层清夜，用移液枪小心取上清液1 ml于试管中，用移液枪加入19 mL 0.2 mg.mL-1盐酸稀释摇匀，在324 nm处测定吸光度,计算提取量。重复2次，取平均值(表1)。

2.3.2 料液比

设定1：6、1：8、1：10、1：12、1：14的5个不同料液比分组，称取5份5.00 g苹果粉，分别加入不同料液比组，置于烧瓶中，在70%乙醇(V/W),80 ℃恒温水浴中回流提取2 h，离心，收集上层清夜，用移液枪小心取上清液1 ml于试管中，用移液枪加入19 mL 0.2 mol.L-1盐酸稀释摇匀，在324 nm处测定吸光度，计算提取量。重复2次，取平均值(表2)。

2.3.3 提取时间

称取5份5.00 g苹果粉，置于烧瓶中，各加入10倍量70%乙醇(V/W),80 ℃恒温水浴中回流，各提取0.5、1、2、3、4 h离心，收集上层清夜，用移液枪小心取上清液1 ml于试管中，用移液枪加入19 mL 0.2 mg.mL-1盐酸稀释摇匀，在324 nm处测定吸光度，计算提取量。重复2次，取平均值(表3)。

3 结果与分析

图2 乙醇浓度对绿原酸提取量的影响

由图2可知，提取剂乙醇的浓度对绿原酸提取量有很大的影响。提取剂乙醇的浓度为70%时绿原酸的提取量达到峰值。提取剂乙醇浓度低，绿原酸提取不完全，提取剂乙醇浓度高乙醇会挥发，导致沸点升高，绿原酸会分解一部分，所以实验中采用70%的乙醇溶液提取。

表2 料液比对绿原酸提取量的影响

表3 提取时间对绿原酸提取量的影响

图3 料液比对绿原酸提取量的影响

由图3可知，绿原酸的提取量随料液比的降低而呈上升趋势，但料液比降低到1：10时，绿原酸的提取量趋于平稳。料液比高时，绿原酸提取不完全，料液比低时，浪费提取剂。综合分析，实验采用1：10料液比加入乙醇溶液提取绿原酸。

图4 提取时间对绿原酸提取量的影响

由图4可知，随着提取时间的增加，绿原酸的提取量呈上升趋势，到2 h时，绿原酸的提取量达到峰值。提取时间超过2 h时，绿原酸的提取量反而降低，可能是绿原酸在长时间加热条件下分解的原因。因此实验中提取绿原酸所采用的时间为2 h。

4 响应曲面法优化绿原酸提取实验设计

表4 苹果中绿原酸的提取响应曲面分析因素水平

为获得最优的绿原酸提取量，通过设计单因素对照实验，筛选出最佳提取条件，在此基础上，采用响应曲面法分析优化，以绿原酸的提取量为参考标准[5]，分别以提取时间(A)，料液比(B)，乙醇浓度(C)，为影响因子，以-1,0,1代表自变量水平，试验因素见表4。

试验在中心点处理3次，其他处理1次，试验1～12号为析因试验，13～15为中心试验，为区域中心点，中心试验重复3次以估计实验误差[6]。表5为Box-Behnken实验设计及结果。

表5 苹果中绿原酸的提取量的响应面试验方案及结果

表6 提取量的估计回归系数

注：S=0.0624390PRESS=0.167617R-Sq=95.97%R-Sq(预测)=65.33%R-Sq(调整)=88.71%

由表6和表7的数据及结果，可以判断出影响绿原酸提取量因素的顺序为料液比(B)>提取时间(A)>乙醇浓度(C)。得到模型的二次多项回归方程Y=2.760+0.013A+0.069B-0.073C-0.161A2-0.192B2-0.163C2-0.055AB+0.123AC-0.077BC。回归模型误差的标准方差S=0.062，回归模型误差占总误差的百分比R-Sq=95.97%，软件Minitab 15调整后的值R-Sq(adj)=88.71%，存在相关性，关系显著。

表7 对于提取量的方差分析

图5 提取率与提取时间(A)、料液比(B)的曲面图和等值线图

图6 提取率与提取时间(A)、乙醇浓度(C)的曲面图和等值线图

图7 提取率与料液比(B)、乙醇浓度(C)的曲面图和等值线图

通过响应曲面图和等值线图，可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响，从而确定最佳提取工艺条件[7]。由于响应曲面图为三维图，只能表达含2个影响因素的函数，故固定其中1个影响因素乙醇浓度(C)。绘制提取时间(A)，料液比(B)对绿原酸提取量影响的响应面图和等值线图(图5)。比较响应曲面图可知，在所选范围内存在极值，即响应面最高点，应用响应优化器可以得出最佳绿原酸提取乙醇浓度为67%[8]；同理根据图6，固定超声时间(A)影响因子，利用响应优化器得出最佳咖啡酸提取时间为1.87 h；根据图7，固定料液比(B)影响因子，利用响应优化器得出最佳咖啡酸提取料液比为1：11。

5 实验结论

在本实验中，采用了乙醇回流法对苹果中的绿原酸进行了提取，通过单因素实验，响应曲面法的优化，最终认为在提取时间为1.87 h、料液比为1：11、乙醇浓度为67%时，绿原酸的提取量达到最大为2.780 mg.g-1。

[1]徐小平.夏果营养足 体键疾病除[J].幼儿教学研究,2007，3(06):54-55.

[2]顾海剑.苹果——增智治病防癌“神果”[J].湘西科技，2002，21(01):26-26.

[3]都国栋.杜仲叶中绿原酸的提取、分离纯化工艺研究[J].贵州大学学报,2006，23(05)：3-11.

[4]龚桂珍，张学俊，兰小艳,等.贵杜仲叶中绿原酸的研究进展[J].中国农学通报,2009，25(21):86-89.

[5]张玲,李继昌,许薇,等.响应曲面法优化蒲公英种的咖啡酸的提取工艺[J].饲料研究，2013,05(01)：83-86.

[6]王明艳,张小杰,王涛,等.响应面法优化香椿叶多糖的提取条件[J].食品科学,2010,31(04)：106-107.

[7]李佩艳,王锋,尹飞,等.响应曲面法优化酶法提取红薯叶总黄酮的工艺[J].食品工业科技，2002,33(01)：275-277+281.

[8]李光,李学兰,孙慧峰,等.响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取条件[J].中国现代中药，2011，13(09):29-33.

[责任编辑：毛微曦 英文编辑：刘彦哲]

Technology Research on Ethanol Reflux Extraction of Chlorogenic Acid in Apple

YANG Xiao-feng

(Department of Biology,Xinzhou Teachers University,Xinzhou，Shanxi 034000,China)

Objective Chlorogenic acid has many benefits to the body,and an apple contains chlorogenic acid.This experiment aims to optimize the extraction of chlorogenic acid in apple.Methods Using ethanol reflux extraction of chlorogenic acid in the apple,the best extraction technology was studied and analyzed.Using single factor design experiment and response surface method,the ethanol concentration,solid-liquid ratio and extraction time were explored and optimized.Under existing experimental conditions,the optimal extraction of chlorogenic acid solutions was found.Results Experiments showed that when the ethanol concentration was 67%,the material-liquid ratio 1：11,and extracting time 1.87 h,the extraction peak of chlorogenic acid content in apple reached 2.780 mg/g.Conclusion Optimizing the extraction solution,more chlorogenic acid can be extracted from apple.

apple;chlorogenic acid;ethanol reflux method;response surface method

杨小峰(1981-)，男，山西繁峙人，忻州师范学院教师，硕士。主要从事物质分离提取和鉴定研究。

F 721.7

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.03.002

来稿日期：2016-10-23