miRNA-29b、MMP-2在大鼠颅内动脉瘤中的相关性及药物干预

彭浩，陈健龙，赵建农，王鹏程，张茂

(海南省人民医院神经外科，海南海口570311)

·论著·

miRNA-29b、MMP-2在大鼠颅内动脉瘤中的相关性及药物干预

彭浩，陈健龙，赵建农，王鹏程，张茂

(海南省人民医院神经外科，海南海口570311)

目的观察miRNA-29b与MMP-2在颅内动脉瘤壁组织中的变化，探讨其在动脉瘤中的相关性及不同药物干预的影响。方法将40只雄性SD大鼠(6周龄)采用随机数字表法分为模型组、多西环素组、丙戊酸钠组和对照组，每组各10只。模型组、多西环素组、丙戊酸钠组大鼠均采用颈外动脉结扎制造颅内动脉瘤模型，对照组大鼠不做造模处理。前三组于造模成功后分别注射生理盐水0.1 mL/(kg·d)、多西环素15 mg/(kg·d)、丙戊酸钠15 mg/(kg·d)，对照组大鼠注射生理盐水0.1 mL/(kg·d)。2个月后取各组动脉组织，采用实时荧光定量PCR检测miRNA-29b的表达，采用免疫组化检测MMP-2的表达。结果模型组、多西环素组、丙戊酸钠组和对照组中miRNA-29b的相对表达量分别为(0.27±0.04)，(0.68±0.03)，(0.47±0.15)，(0.95±0.12)，差异均有显著统计学意义(F= 10.235，P<0.01)；miRNA-29b表达量经两两比较，模型组明显低于对照组，丙戊酸钠组明显高于模型组，而多西环素组明显高于丙戊酸钠组，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组、多西环素组、丙戊酸钠组和对照组中MMP-2阳性细胞数分别为(21.10±3.36)，(10.27±1.20)，(15.24±2.13)，(4.50±0.44)，差异均有显著统计学意义(F=6.013，P<0.01)；MMP-2阳性细胞数经两两比较，模型组明显高于对照组，丙戊酸钠组明显低于模型组，而多西环素组则明显低于丙戊酸钠组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-29b、MMP-2的表达水平与颅内动脉瘤的发生相关，多西环素对MMP-2的抑制作用明显强于丙戊酸钠。

颅内动脉瘤；miRNA-29b；MMP-2；多西环素；丙戊酸钠

近年来，微小RNA(microribonucleic acids，miRNA)与疾病发生发展的相关性研究得到了广泛的开展。在众多miRNA中，miRNA-29家族是当前研究的热点。有研究表明，miRNA-29b在颅内动脉瘤中表达水平下调[1]。也有研究表明miRNA-29可以调控基质金属蛋白酶2(matrix metallalloproteinases 2，MMP2)的生成[2]。目前对于miRNA-29b与MMP-2在颅内动脉瘤中的作用机制尚鲜见报道，本课题对miR-NA-29b、MMP-2在颅内动脉瘤中的表达、作用机制进行了初步研究，并应用多西环素、丙戊酸钠对动脉瘤予以干预，旨在为临床治疗颅内动脉瘤提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性SD大鼠40只，6周龄，体质量200～250 g，无特定病原体级(SPF级)，购自广东医科大学动物实验中心[实验动物生产许可证号；SCXK(粤)2013-0008，清洁级：2级]。

1.2 主要试剂RNA提取试剂购自北京博奥森生物技术有限公司；miRNAReverse Transcription试剂盒、SYBR Green Mix Kit购自德国凯杰Qiagen公司；PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；miRNA-29b购自锐博公司；蛋白提取试剂及BCA定量试剂盒购自碧云天公司；一抗(兔抗人MMP-2多克隆抗体，编号：ZA0331)、二抗(超敏试剂盒，编号：PV9001)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 模型建立及实验分组将40只雄性SD大鼠(6周龄)采用随机数字表法分为四组：对照组、模型组、多西环素组、丙戊酸钠组，每组10只。模型组、多西环素组、丙戊酸钠组大鼠采用颈外动脉结扎制造颅内动脉瘤模型，对照组大鼠不做相应处理。造模方法：30只大鼠用猪胰弹性蛋白酶滴加到颈外动脉及分叉处动脉壁周围，在颈外动脉距分叉处约1.5 mm位点，用两根手术线结扎颈外动脉，在两根线之间剪断颈外动脉，使颈外动脉的盲段形成颈内动脉的一个动脉瘤。术后1周开始1%盐水饲养。1个月后行脑血管造影，观察动脉瘤形成情况。饲养室温保持在18℃～20℃环境，相对湿度40%～70%。造模成功后，多西环素组于腹腔内注射多西环素15 mg/(kg·d)，丙戊酸钠组于腹腔内注射2%丙戊酸钠200 mg/(kg·d)，持续1个月。模型组与对照组皮下注射生理盐水0.1 mL/(kg·d)。术后2个月，处死动物，从大鼠颈总动脉分叉部取动脉瘤组织标本和对照组正常动脉组织标本。

1.4 检测方法

1.4.1 miRNA-29b的检测按照SYBR Green PCR试剂盒说明书，以逆转录合成的cDNA作为模版在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪上进行反应。反应体系为：模版cDNA 0.2 μL，miRNA-29b特异性引物0.6 μL，2 X QuantiTect SYBR Green PCR Mix 5μL，miRNA-29b上游引物5'-CTGACGGAGTTCCTCCAG TTC-3'，下游引物5'-GAGGTTCCCCGAGAAGACGA T-3'；U6作为内参，其上游引物为5'-CTCGCTTCGGC AGCACA-3'，下游引物为5'-ACGCTTCACGAATTTG CGT-3'，加DEPC水至总体积为10 μL。PCR反应条件为：95℃5 min，95℃5 s，60℃30 s，共40个循环。经扩增得到各目的基因的循环阈值(Ct)值，以2-ΔΔCT相对定量的方法分析miRNA-29b与U6拷贝数的比值。

1.4.2 免疫组化检测MMP-2标本离体后2 h内，经10%甲醛固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片。然后应用免疫组化SABC染色法检测组织中MMP-2的表达。阳性细胞表达计数：每张切片随机选取5个400倍视野。

2 结果

2.1 miRNA-29b在四组中的表达四组miRNA-29b琼脂糖凝胶电泳结果见图1。定量分析显示miRNA-29b在模型组、多西环素组、丙戊酸钠组、对照组中的相对表达量分别为(0.27±0.04)，(0.68±0.03)，(0.47±0.15)，(0.95±0.12)，差异有统计学意义(F= 10.235，P=0.000)。模型组中miRNA-29b表达量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。丙戊酸钠组中miRNA-29b表达明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，而多西环素组中miRNA-29b表达明显高于丙戊酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 四组miRNA-29b琼脂糖凝胶电泳结果注：M：100 bp Ladder DNAmarker，条带由上至下依次为：1 500 bp，1 000 bp，900 bp，800 bp，700 bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp。1～5：模型组；6～9：多西环素组；10～13：丙戊酸钠组；14～17：对照组。

2.2 MMP-2在四组中的表达MMP-2阳性表达主要表现为在细胞浆着色呈棕色或棕黄色。模型组、多西环素组、丙戊酸钠组、对照组切片在显微镜下观察均有棕黄色的细胞出现(见图2)，MMP-2阳性细胞数分别为(21.10±3.36)，(10.27±1.20)，(15.24± 2.13)，(4.50±0.44)，差异有统计学意义(F=6.013，P= 0.000)。模型组阳性细胞数明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；丙戊酸钠组阳性细胞数明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，而多西环素组阳性细胞数明显低于丙戊酸钠组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 四组MMP-2免疫组化染色图(×400)

3 讨论

近几年来，一些疾病与小分子RNA(microRNA，miRNA)之间的关系引起许多学者的关注[3-4]，但miRNA在脑血管疾病中的研究相对缺乏。以miRNA为研究基础探讨其在脑动脉瘤中的相关性，对发现脑动脉瘤的病因与治疗等具有重要作用[5]。任何机体的组成部分在不同的时间表达不一样的miRNA谱，且一个miRNA可控制多个靶基因。miRNA和靶基因组成了复杂的调节网络，影响着几乎所有的信号通路，参与多种病理生理过程[6]。Merk等[7]发现过表达miRNA-29b会导致严重的腹主动脉瘤扩张。同时，作为miRNA-29b的靶基因，Col1al、Col3al、Col5al、Eln等参与到了疾病的发生、发展中。也有研究表明在马方综合征小鼠模型中，miRNA-29b的表达量显著增加，且TGF-β作为它的靶基因，抑制TGF-β的生成，从而导致细胞外基质的破坏，不能发挥正常的作用[8]。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)主要由体内四种细胞产生，包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，其作用是破坏细胞外基质的组成部分，如胶原蛋白、弹性蛋白和非胶原糖蛋白等，导致了细胞外基质的改变，进而损坏动脉管壁的整体性[9]。研究发现无论在人腹主动脉瘤还是大鼠腹主动脉瘤模型中，MMP-2都有不同程度的表达增高[10]。Mandelbaum等[11]在研究脑动脉瘤标本中，发现瘤壁上MMP-2的表达量显著高于对照组。MMP-2的表达量上升使胞外基质结构出现破坏，从而在导致脑动脉瘤的出现。有研究表明多西环素能够下调MMP-2，从而降低大鼠脑动脉瘤的发生率[12]。也有研究表明丙戊酸钠可以通过抑制细胞周期的方式，抑制动脉瘤平滑肌细胞的表型转化，降低细胞增殖水平，减少基质金属蛋白酶的分泌，从而抑制动脉瘤的形成[13]。

在本实验中，miRNA-29b在颅内动脉瘤组织的表达明显低于正常脑血管动脉组织中的表达，与文献报道一致[1]。MMP-2在颅内动脉瘤组织中高表达，明显高于正常脑血管动脉组织中的表达，表明miRNA-29b、MMP-2的表达水平与动脉瘤的形成有关。有研究表明MMP-2的表达受miRNA-29b的调控[2]。在正常脑血管组织中，miRNA29b高表达，可能抑制了MMP-2的表达，从而阻断了对细胞外基质的破坏；在颅内动脉瘤中，由于miRNA-29b的表达明显减少，可能失去了对MMP-2的调控，导致MMP-2的增加，从而出现细胞外基质的降解，导致发生动脉瘤的概率增大。但是在本实验中，多西环素组与丙戊酸钠组MMP-2的表达较模型组明显减少，表明多西环素和丙戊酸钠在动脉瘤形成后抑制了MMP-2的生成，同时由于MMP-2的减少可能减少了对miRNA-29b的消耗，因此miRNA-29b较模型组明显增加。实验结果表明，多西环素对MMP-2的抑制作用强于丙戊酸钠。因此，多西环素可作为一种神经保护剂，在脑动脉瘤治疗中起到一定的保护作用。

[1]张明铭.颅内动脉瘤的miRNA、mRNA表达谱及其分子网络调控研究[D].长沙:中南大学,2013

[2]Steel R,Mott JL,Ray RB.MBP-1 upregulates miR-29b,which represses Mcl-1,collagens,and matrix metalloproteinase-2 in prostate cancer cells[J].Genes Cancer,2010,1(4):381-387

[3]Havelange V,Garzon R.MicroRNAs:emerging key regulators of hematopoiesis[J].AM J Hematol,2010,85(12):935-942.

[4]Davidson-Moncada J,Papavasiliou FN,Tam W.MicroRNAs of the immune system:roles in inflammation and cancer[J].Ann NY Acad Sci,2010,1183:183-194.

[5]Chen K,Rajewsky N.The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs[J].Nat Rev Genet,2007,8(2):93-103.

[6]Tong AW,Nemunaitis J.Modulation of miRNA activity in human cancer:a new paradigm for cancer gene therapy[J].Cancer Gene Ther,2008,15(6):341-355.

[7]Merk DR,Chin JT,Dake BA,et al.miR-29b participates in early aneurysm development in Marfan syndrome[J].Circ Res,2012,110 (2):312-324.

[8]Bor AS,Rinkel GJ,Adami J,et a1.Risk of subarachnoid haemorrhage according to number of affected relatives:a population based case-control study[J].Brain,2008,131(Pt 10):2662-2665.

[9]Takai S,Jin D,Yamamoto D,et al.Significance of matrix metalloproteinase-9 inhibition by imidapril for prevention of abdominalaortic aneurysms in angiotensinⅡtype 1 receptor-knockout mice[J].J Pharmacol Sci,2013,123(2):185-194.

[10]Mi T,Nie B,Zhang C,et al.The elevated expression of osteopontin and NF-kappaB in human aortic aneurysms and its implication[J]. JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2011,31(5):602-607.

[11]Mandelbaum M,Kolega J,Dolan JM,et al.A critical role for proinflammatory behavior of smooth muscle cells in hemodynamic initiation of intracranial aneurysm[J].PLoS One,2013,8:e74357.

[12]付强,吕涛,关俊宏.大鼠脑动脉瘤形成过程中MMP-2、MMP-9动态变化及多西环素对其的抑制作用[J].山东医药,2015,55(20): 25-27.

[13]汤锐.丙戊酸对大鼠胸主动脉瘤抑制作用及机制[M].北京:中国医科大学,2015.

Correlation of miRNA-29b with MMP-2 in intracranial aneurysms of rats and drug intervention.

PENG Hao,CHEN Jian-long,ZHAO Jian-nong,WANG Peng-cheng,ZHANG Mao.Department of Neurosurgery,Hainan Provincial People's Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the change of miRNA-29b and MMP-2 in the intracranial aneurysm wall and their correlation,and to explore drug treatment in aneurysm.MethodsForty SD male rats of six weeks'old were randomly divided into four groups:model group(n=10),doxycycline group(n=10),sodium valproate group(n=10), control group(n=10).The last three groups were performed ligation of the external carotid artery to establish intracranial aneurysm model,while rats in the control group were not treated.Then rats of the four groups were injected with saline 0.1 mL/(kg·d),doxycycline 15 mg/(kg·d),sodium valproate 200 mg/(kg·d),saline 0.1 mL/(kg·d)respectively after establishing model successfully.After two months,the intracranial aneurysm tissue and normal arterial tissue were taken.The expression of miRNA-29b was detected by real-time quantitative PCR(qPCR),and the expression of MMP-2 was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of miRNA-29b in model group(0.27±0.04) was significantly lower than that in the control group(0.95±0.12);sodium valproate(0.47±0.15)significantly improves the level of miRNA-29b(as compared with the model group),and doxycycline(0.68±0.03)further improves the level significantly(as compared with the sodium valproate group);all the differences were statistically significant(P<0.05).The expression of MMP-2 in the model group(21.10±3.36)was significantly higher than that in the control group(4.50±0.44);sodium valproate(15.24±2.13)significantly decreases the level of MMP-2(as compared with the model group),and doxycycline(10.27±1.20)further decreases the level significantly(as compared with the sodium valproate group);all the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression level of miRNA-29b and MMP-2 may be related to the development of intracranial aneurysms.And the inhibitory effect of doxycycline on MMP-2 was significantly stronger than sodium valproate.

Intracranial aneurysm;miRNA-29b;MMP-2;Doxycycline;Sodium valproate

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.10.001

R-332

A

1003—6350（2017）10—1549—03

2016-12-23)

海南省自然科学基金(编号：20158354)

陈健龙。E-mail：274619891@qq.com