子宫内膜癌组织中长链非编码RNA ANRIL的表达变化及其意义

殷悦，姜霞，代丽丽，魏旭静，李林，李义飞

(河北医科大学第一医院，石家庄 050031)

·临床研究·

子宫内膜癌组织中长链非编码RNA ANRIL的表达变化及其意义

殷悦，姜霞，代丽丽，魏旭静，李林，李义飞

(河北医科大学第一医院，石家庄 050031)

目的 观察子宫内膜癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)ANRIL的表达变化，并探讨其临床意义。方法 子宫内膜癌患者40例(观察组)，均行子宫切除术，术中留取子宫内膜癌组织；另选择因阴道异常出血行宫腔镜刮宫活检或因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者40例(对照组),术中留取正常子宫内膜组织标本。采用实时荧光定量PCR法检测两组组织ANRIL，分析ANRIL表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系。结果 观察组、对照组组织中ANRIL的相对表达量分别为19.89(5.26，61.42)和6.08(1.62，27.79)，两者相比，P<0.05。观察组病理分级为Ⅰ+Ⅱ级、Ⅲ级组织中ANRIL的相对表达量分别为6.12(1.58，24.65)、15.21(6.12，59.73)，两者相比，P<0.05。ANRIL表达与子宫内膜癌患者年龄、FIGO病理分期及有无盆腔淋巴结转移、是否合并高血压、糖尿病、雌激素及孕激素水平均无关(P均>0.05)。 结论 子宫内膜癌组织中ANRIL表达升高，ANRIL可能参与了子宫内膜癌的发生、发展。

子宫肿瘤；子宫内膜癌;长非编码RNA；长链非编码RNA ANRIL

长链非编码RNA(LncRNA)是指长度超过200个核苷酸(nt)且不能编码蛋白的RNA片段[1]。lncRNA之前被认为是没有生物学功能的转录组“背景噪音”，但随着分子生物学的研究进展发现其可作为功能分子在染色质修饰与重塑、端粒的维持、调控细胞分化与细胞周期等多层面发挥着重要生物学调控作用[3，4]。ANRIL是lncRNA的一种，被认为是膀胱癌、前列腺腺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌等多种恶性肿瘤的致癌基因。目前关于ANRIL在子宫内膜癌组织中表达情况的相关报道较少。2015年12月～2016年10月，本研究观察了子宫内膜癌组织中ANRIL的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2009年4月～2015年12月在河北医科大学第一医院治疗的子宫内膜癌患者40例(观察组)，年龄37～65岁，中位年龄55岁；病理分级为Ⅲ级13例、Ⅰ+Ⅱ级27例；均行子宫切除术，术中留取子宫内膜癌组织，手术分期符合2009年国际妇产科联盟(FIGO)修订的子宫内膜癌手术分期标准，术前均未接受全身或局部的放疗及药物治疗。另选择因阴道异常出血行宫腔镜刮宫活检或因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者40例(对照组)，年龄31～67岁，中位年龄51岁，术中留取正常子宫内膜组织标本。标本获得后置于液氮中低温储存备用。所有标本均经患者及家属知情同意，病理诊断证实。两组患者年龄差异无统计学意义。所有患者均排除心、肝、肾等重要脏器疾病。

1.2 子宫内膜癌组织中ANRIL检测方法 采用实时定量PCR法。TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司，RevertAid First strand cDNASynthesis Kit试剂盒购自Thermo Fisher公司，实时荧光定量PCR选用UltraSYBR Mixture(With RoxⅠ)购自康为世纪公司，内参β-actin、ANRIL引物均购自Invitrogen公司。分别取两组标本，严格按照TRIzol试剂盒使用说明书提取总RNA。选用RevertAid First strand cDNASynthesis Kit试剂盒，采用T100 Thermal Cycler PCR仪(购自美国Bio-Rad公司)对提取总RNA进行反转录合成cDNA。ANRIL上游引物5′-GCGCCGGACTAGGACTATTT-3′，下游引物5′-GCCAGGACGGAGATCAGATG-3′；内参β-actin引物序列：上游引物5 ′-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，下游引物5′-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG-3′，产物长度153 bp。反应体系20 μL：1.2×UltraSYBR 混合物10 μL、上游引物(10 μmol/mL)0.4 μL、下游引物(10 μmol/mL)0.4 μL、cDNA 1 μL、去核糖核酸酶水8.2 μL。反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s,60 ℃、1 min，42个循环。以2-ΔΔCt代表ANRIL的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行统计分析。本研究为计量资料不符合正态性以(四分位数间距)表示P50(P25，P75)，组间比较采用两独立样本t检验、方差分析(ANOVA)，不符合正态分布的资料用非参数检验。ANRIL的表达量在不同子宫内膜组织及内膜癌患者不同临床病理参数中的比较用Mann-Whitney法检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组、对照组组织中ANRIL的相对表达量分别为19.89(5.26，61.42)和6.08(1.62，27.79)，两者相比，P<0.05。观察组病理分级为Ⅰ+Ⅱ级、Ⅲ级组织中ANRIL的相对表达量分别为6.12(1.58，24.65)、15.21(6.12，59.73)，两者相比，P<0.05。

ANRIL表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系见表1。由表1可见，ANRIL表达与子宫内膜癌患者年龄、FIGO病理分期及有无盆腔淋巴结转移、是否合并高血压、糖尿病、雌激素及孕激素水平无关(P均>0.05)。

表1 ANRIL表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系

3 讨论

子宫内膜癌是子宫内膜发生的癌，绝大多数为腺癌，它是妇科最为常见的三大恶性肿瘤之一，其发病率和病死率逐年上升[5]，对女性健康和生命构成严重的威胁，因此探索子宫内膜癌发生、发展的分子生物学机制,寻找新型肿瘤分子标记物和治疗靶点，有助于子宫内膜癌患者早期发现、诊断、治疗，从而实现提其高生存质量，延长寿命，降低病死率的目标。

LncRNA由于其不能编码蛋白一直被认为“转录过程的副产物”而被人们忽视，然而近年来越来越多的研究表明，LncRNA在错综复杂的机体调控网络中扮演重要角色，它做为功能分子参与表观遗传、转录调控以及转录后的调控[6]。像编码蛋白质的对应产物一样，LncRNA也受到典型的转录因子和表观遗传调节。例如EZH2可表观的抑制 lncRNA SPRY4-IT1 在非小细胞肺癌中的表达[7]，随着DNA的损伤ANRIL被转录因子E2F1 反式激活[8],HOTAIR被缺氧诱导因子-1α反式激活,原癌基因已被证明在多种人类肿瘤中存在高表达[9]，原癌基因作为关键的转录因子,在调节许多细胞生物过程,包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞代谢中起着至关重要的作用 。研究证实lncRNA与人类肿瘤的发生、发展密切相关。Zhao等[11]研究发现子宫内膜癌中长链非编码RNA MALAT1的转录受到Wnt/β-catenin信号通路启动子TCF的调控，并且PCDH10也是通过抑制该通路实现对MALAT1的调节，从而使其表达水平下调。Liu等[19]应用实时荧光定量PCR技术检测了胃癌及癌旁组织中长链非编码RNA FEZF1-AS1的表达量，发现其在癌组织的表达水平明显高于癌旁组织，还发现 FEZF1-AS1的表达量与肿瘤的TNM分期、瘤体大小及预后呈明显相关性，他们还利用RNA结合蛋白免疫沉淀实验和RNA-pulldown实验证明了长链非编码RNA FEZF1-AS1通过结合赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)表观的抑制了p21的表达，从而促进了胃癌的增殖[12]。

LncRNA 家族成员之一的ANRIL(INK4位点的长链反义非编码RNA)最早是Pasmant等[13]在患有神经系统肿瘤和INK4B-ARFINK4A基因丛完全缺失的家族性黑素瘤的患者中发现的。目前多数对ANRIL功能的研究，很多是通过RNA干扰技术造成其功能缺失实现的。实验表明特异性的RNA干扰能下调ANRIL的表达，并且能够显著抑制非小细胞肺癌的增殖。研究发现在ANRIL启动子区域原癌基因与E-box直接结合诱导了ANRIL的表达[18]。ANRIL的沉默也可以使原癌基因诱导细胞促生长的趋势减弱。这与Qiu等[14]的研究结果一致，其探讨的卵巢癌发病机制认为，ANRIL的过表达使 bcl - 2蛋白和mRNA水平增加，促进癌细胞增殖，抑制细胞凋亡。ANRIL可作用于特定独立基因,抑制其邻近的肿瘤抑制因子包括P14ARF(p53通路的调节因子)以及两个周期蛋白依赖性激酶抑制剂P15INK4B、P16INK4A分子，其中P15INK4B在细胞增殖、细胞周期进程、细胞复制衰老过程中发挥重要作用[15]。Huang等[16]发现ANRIL在肝细胞癌中的表达水平被上调，并且其表达水平与肿瘤的大小及巴塞罗那临床肝癌分级密切相关，同时其还发现ANRIL是通过抑制KLF2蛋白的转录来实现其调节肝癌细胞的增殖和侵袭的。古松钢等[17]用免疫组化SP法和实时荧光定量PCR法检测结、直肠癌组织及对应癌旁正常组织中ANRIL的表达水平，发现ANRIL在癌组织中的表达量明显高于正常组织。Zhu等[18]通过研究ANRIL在膀胱癌和相应癌旁组织中的表达水平及T24和 EJ细胞株转染后增殖和凋亡情况，首次提出ANRIL可能是膀胱癌的促癌基因，其通过内在细胞凋亡途径调节膀胱癌细胞的增殖和凋亡。

然而关于ANRIL在子宫内膜癌组织中表达水平及其如何调节下游分子引起发病机制的研究仍不明确。本研究采用实时荧光定量的方法检测ANRIL在子宫内膜不同子宫内膜组织的相对表达量，发现ANRIL在子宫内膜癌组织中的表达水平明显高于正常子宫内膜组织，并且病理分级为Ⅲ级的癌组织中ANRIL的表达水平也明显高于其在Ⅰ+Ⅱ级癌组织中的表达水平,且差异具有统计学意义。推测ANRIL可能在子宫内膜癌发生、发展过程中发挥一定的调节作用。其具体机制可能为：ANRIL通过绑定PRC2抑制KLF2和P21的转录，从而影响子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡。

综上所述，子宫内膜癌组织中ANRIL表达升高，ANRIL可能参与了子宫内膜癌的发生、发展。

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河北省自然科学基金资助项目(H2012206040)。

张红真(E-mail： 974081280@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.014

R711.74

B

1002-266X(2017)19-0048-03

2016-11-01)