Toll样受体4特异性拮抗剂TAK-242对人卵巢癌细胞株SKOV-3增殖、凋亡的影响及其机制

魏蔚，刘玉华，刘守燕

(1平顶山学院医学院,河南平顶山467000；2平顶山市第一人民医院)

Toll样受体4特异性拮抗剂TAK-242对人卵巢癌细胞株SKOV-3增殖、凋亡的影响及其机制

魏蔚1，刘玉华1，刘守燕2

(1平顶山学院医学院,河南平顶山467000；2平顶山市第一人民医院)

目的 观察Toll样受体4(TLR4)特异性拮抗剂TAK-242对人卵巢癌细胞株SKOV-3增殖、凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。方法 取对数生长期人卵巢癌SKOV-3 细胞分为A组、B组、对照组及空白组， A、B组分别加入终浓度为20、40 nmol/L的 TAK-242培养，对照组加入1% DMSO，空白组不做任何处理。采用MTT比色法观察给药24、48、72 h时各组细胞增殖情况，采用Annexin-V/PI观察给药24、48、72 h时各组凋亡细胞。采用Western blotting法检测给药48 h时各组细胞核因子-κB (NF-κB )p65、总蛋白细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cleaved-caspse 3)。结果 给药24、48、72 h时，A、B组细胞增殖抑制率均高于对照组、空白组(P均<0.05)；给药24、48、72 h时， B组细胞增殖抑制率均高于A组(P均<0.05)；随给药时间延长，B组细胞增值抑制率升高(P均<0.05)。给药24、48、72 h时，A、B组细胞凋亡率均高于对照组、空白组(P均<0.05)；TAK-242浓度升高，细胞凋亡率升高，随给药时间延长，细胞凋亡率升高(P均<0.05)；随给药时间增加，B组细胞增值抑制率升高(P均<0.05)。给药48 h时，细胞NF-κB p65、Cyclin D1蛋白相对表达量低于空白组和对照组，cleaved-caspase 3相对表达量高于空白组和对照组(P均<0.05)。结论 TAK-242可抑制人卵巢癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，其机制可能为NF-κB信号通路功能被抑制。

卵巢肿瘤；卵巢癌；Toll样受体4；细胞增殖；细胞凋亡

卵巢癌是我国常见的妇科肿瘤，发病率和病死率均较高[1, 2]。化疗是卵巢癌的常用治疗方法[3, 4]。但化疗药物可导致患者出现耐药性，不良反应较多，因此开发出新型、高效的化疗药物对改善卵巢癌患者的预后具有重要临床意义[5, 6]。Toll样受体4(TLR4)属于Ⅰ型跨膜蛋白，分布于多种组织细胞中，可通过NF-κB信号通路或JNK/SAPK激活途径激发人体抗感染过程[3, 7]。核因子-κB (NF-κB )p65、总蛋白细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cleaved-caspse 3)是常用的NF-κB信号通路检测指标。既往研究发现，TLR4在卵巢癌的发生、发展中可能发挥重要作用[7]，但其具体机制目前尚不明确。我们观察了TLR4新型特异性选择性拮抗剂TAK-242[8]对人卵巢癌细胞株SKOV-3增殖、凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人卵巢癌SKOV-3 细胞株购自中科院上海细胞所，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，MTT试剂盒购自美国Sigma公司，cleaved-caspase 3、H3、CyclinD1、p65和H3，β-actin的抗体均购自美国cell signaling公司。免疫印迹电泳装置、凝胶成像仪均购自中国天能公司。

1.2 SKOV-3 细胞分组及TAK-242给药方法 取人卵巢癌SKOV-3 细胞株，复苏后接种于培养瓶中，培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640培养液， 37 ℃饱和湿度、5% CO2的孵箱中培养， 24～48 h换液一次。取处于对数生长期SKOV-3细胞，按照5×105/100 μL的密度接种于96孔板中。培养24 h时将细胞分为A、B组、对照组及空白组，每组9个复孔，A、B组分别加入终浓度为20、40 nmol/L的 TAK-242培养(剂量选择参照文献[9])，对照组加入1% DMSO，空白组不做任何处理，将各组细胞置于37 ℃饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，备用。

1.3 各组细胞增殖情况观察 采用MTT比色法。分别取给药24、48、72 h时各组细胞，PBS洗涤2次，接种于96孔板中，每组9个复孔。每孔加入50 mL 0.5 mg/mL MTT溶液，持续孵育4 h，吸除上清液，然后每孔加入150 μL的DMSO，在振荡器上震荡10 min。采用自动酶标仪检测各组细胞在490 nm波长处的光密度值(OD)，取9个复孔的平均值。采用GraphPad Prism软件计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-OD实验组/OD空白组)×100%。

1.4 各组细胞凋亡情况观察 采用Annexin-V/PI检测各组细胞凋亡情况。分别取给药24、48、72 h时各组细胞，PBS洗涤2次，不含有EDTA胰酶消化，冷PBS洗涤，收集细胞，加入100 μL的结合缓冲液悬浮细胞，5 μL的Annexin V-FITC并充分混匀，再加入5 μL的PI并混匀，室温、避光条件下反应10 min后，用流式检测专用的试管收集标本并上机检测， 最后置于荧光显微镜下观察各组细胞形态学变化：早期凋亡细胞呈现核浓缩伴随染色加深，或核染色质呈新月形聚集于核膜一边；晚期的凋亡细胞则表现为核碎裂成大小不等的圆形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。凋亡率计算方法：在200×视野下随机找5个视野观测，每个视野计数200个细胞，以计算平均凋亡细胞数所占百分比作为细胞凋亡率，实验重复5次，取平均值。

1.5 各组细胞NF-κB p65、总蛋白cyclin D1、cleaved-caspse 3蛋白检测 采用Western blotting法。取给药48 h对数生长期B组、对照组及空白组细胞，4 ℃预冷PBS洗涤3次，使用裂解液裂解细胞，1 500 r/min离心15 min,采用BCA法提取细胞总蛋白，所有操作均严格按照使用说明书进行。以3∶1体积比与上样缓冲液混合,取20μL蛋白样品上样。浓缩胶电泳电压为80 V,分离胶为130 V,电泳4 h后用PVDF膜半干转，转膜1.5 h。然后PVDF膜用含5%脱脂奶粉的PBS液封闭1 h，H3、NF-κB p65、,CyclinD1、β-actin和cleaved-caspase 3抗体用5%牛奶稀释(1∶1 000)后，4 ℃过夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，洗膜，按照ECL说明书，1∶1配置发光工作液，超敏化学发光法显色,凝胶分析系统分析记录条带光密度。用Image J软件进行分析,以相应目的蛋白条带的积分光密度值与β-actin或H3的比值表示检测蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 不同给药时间各组细胞增殖抑制率比较见表1。

表1 不同给药时间各组细胞增殖抑制率比较

注：与空白组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05；与A组比较，&P<0.05；与前一给药时间比较，△P<0.05。

2.2 各组细胞凋亡率比较 不同给药时间各组细胞凋亡率比较见表2。

表2 不同给药时间各组细胞凋亡率比较

注：与空白组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05；与A组比较，&P<0.05；与前一给药时间比较，△P<0.05。

2.3 各组细胞NF-κB p65、cleaved-caspase 3及Cyclin D1蛋白相对表达量比较 前期实验证实高剂量TAK-242对SKOV-3细胞增殖、凋亡的影响更明显，仅用B组细胞进行机制探讨。各组细胞p65、cleaved-caspase 3及cyclin D1蛋白相对表达量比较见表3。

表3 给药48 h时各组细胞NF-κB p65、cleaved-caspase 3及cyclin D1蛋白相对表达量比较

注：与空白组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

TLR4属于一型跨膜蛋白[10]，在结构上由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。随着研究的深入，发现TLR4在促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应；促进免疫细胞膜表面表达相关免疫分子，促进免疫细胞的成熟和功能化；抗病毒感染；调节免疫应答；介导全身免疫病理损伤，以及其家族间的协同作用影响免疫应答等方面起到重要的作用。TLR4信号通路的传导主要包括髓样分化因子(MyD88)非依赖性和MyD88依赖性两条信号通路，前者不依赖于MyD88蛋白的激活作用，主要通过IRF-3来延迟性激活NF-κB的活性；后者主要通过MyD88的激活，从而快速的上调NF-κB的活性。NF-κB是卵巢癌发病机制中的重要参与者，抑制NF-κB的活性可以抑制卵巢癌细胞的增殖和促进其凋亡[11]。在正常条件下，NF-κB主要通过与其抑制性亚单位IκBα结合存在于胞浆中，当TLR4介导的信号通路传导至IκBα时，可以使IκBα发生泛素化降解，脱离IκBα束缚的NF-κB p65从胞浆中转位至胞核内，并与特异的靶基因序列结合，从而调控下游相关目的基因cyclin D1和cleaved-caspase 3蛋白的表达[11]。在以往研究中发现，TLR4在卵巢癌肿瘤标本中的表达明显升高，并与卵巢癌患者的病情进展存在显著相关性[13]，使用抑制TLR4表达的药物可以显著抑制NF-κB的活性，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和促进凋亡，提示TLR4有可能成为卵巢癌治疗的重要靶点。TAK-242是TLR4的特异性抑制剂[14]，目前证实其在体外细胞培养实验中具有抗肿瘤作用，但是对于其在卵巢癌细胞增殖和凋亡中的作用目前相关报道却不多。

本研究结果表明，给药24、48、72 h时，A、B组细胞增殖抑制率、凋亡率均高于对照组、空白组；给药24、48、72 h时， B组细胞增殖抑制率均高于A组；随给药时间增加，B组细胞增值抑制率、凋亡率升高。说明TAK-242可抑制卵巢癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，并呈现剂量依赖性。在后续研究中，本研究对其机制进行了进一步探讨，研究结果表明，TAK-242可以显著抑制核内转录因子p65蛋白的表达水平。caspase 3是卵巢癌发生细胞凋亡过程中的关键性调节蛋白[12]，caspase 3蛋白的表达受NF-κB的调节[13]，其主要通过裂解后的cleaved-caspase 3成熟体发挥作用，因此本研究进一步探讨了TAK-242对于cleaved-caspase 3蛋白表达的影响，结果表明，TAK-242可以显著增加cleaved-caspase 3蛋白的表达水平，这可能是其发挥促凋亡的机制之一。Cyclin D1是卵巢癌细胞增殖的关键调节蛋白[14]，其表达同样受NF-κB的调节[15]。因此，本研究探讨了TAK-242对cyclin D1蛋白表达的影响，结果表明，TAK-242可以显著抑制cyclin D1蛋白的表达，提示这可能是TAK-242抑制卵巢癌细胞增殖的机制之一。

综上所述，TAK-242可抑制人卵巢癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，其机制可能为抑制NF-κB信号通路。但本研究仅为体外细胞培养实验，未来需在动物实验中进一步去验证TAK-242对人卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。

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刘玉华(E-mail: weiweijudy@163.com)

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A

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2016-10-24)