肺鳞癌细胞中PTHrP基因表达与性激素的相关性研究

陈晓露，吴蓉宜，董玉洁△

(1.乐山职业技术学院医学系，四川乐山 614000；2.四川省成都市第六人民医院病理科 610051)

肺鳞癌细胞中PTHrP基因表达与性激素的相关性研究

陈晓露1，吴蓉宜2，董玉洁1△

(1.乐山职业技术学院医学系，四川乐山 614000；2.四川省成都市第六人民医院病理科 610051)

目的 研究人的雌性激素17β-雌二醇和雄性激素睾酮对肺鳞癌细胞中甲状旁腺激素相关蛋白甲状旁腺素相关肽(PTHrP)基因表达的影响。方法 分别用17β-雌二醇和睾酮按不同的浓度梯度刺激肺鳞癌细胞的生长，利用EVA荧光实时定量PCR技术检测各浓度雌雄性激素刺激作用后肺鳞癌细胞中PTHrP基因表达的情况。结果 肺鳞癌细胞中PTHrP基因相对表达量随着睾酮浓度的增加而递减，但是17β-雌二醇作用后，PTHrP基因相对表达量没有明显的增强和减弱的趋势。结论 睾酮对肺鳞癌细胞中PTHrP基因表达起负调节作用，而17β-雌二醇对PTHrP基因表达的调节作用不明显。

癌，鳞状细胞；肺肿瘤；甲状旁腺激素相关蛋白质；PTHrP；睾酮；17β-雌二醇

肺癌是最常见的肺部原发性恶性肿瘤，是癌症死亡的主要原因之一。71%的肺癌患者都是由于吸烟导致[1-2]。有资料显示，比起男性吸烟者，女性吸烟者更容易患上肺癌，但是女性患者预后较男性患者好，通常具有较长的生存期[3-4]。这表明性别可能是影响肺癌生长的潜在因素之一。甲状旁腺激素相关蛋白甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在男、女肺癌细胞中的表达存在着明显的差异[5]。PTHrP最初是从与高钙血症相关的恶性肿瘤组织中分离出的一种在结构上与甲状旁腺激素PTH相类似的因子[6-7]。后期的研究表明，PTHrP同样在延迟肿瘤的生长、延长患者的生存期方面具有很大的影响[8-11]。本研究中选用EvaGreen作为荧光指示剂做实时定量PCR，研究人的雌雄性激素对肺鳞癌细胞中PTHrP的基因表达调控影响，分析两者之间的关系，为判断男、女性肺癌患者临床预后情况提供指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验细胞 肺鳞癌细胞株YTMLC由成都市第六人民医院提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 RPMI-1640细胞培养基为Hyclone公司产品；无酚红1640细胞培养基为Gibco公司产品；无支原体特级胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；活性炭处理/透析特级胎牛血清为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基甲酮(TPCK)处理的胰酶为上海晶纯公司产品；雄性激素睾酮testosterone和雌性激素17β-雌二醇17β-Estradiolum为Sigma公司产品；细胞培养瓶及细胞培养6孔板均为Coring公司产品；RNApure 高纯总RNA快速抽提试剂盒(离心柱型)为北京百泰克生物技术有限公司；逆转录试剂盒为MBI Fermentas公司产品；SoFast EvaGreen supermix荧光染料混合物为BIO-RAD公司产品；细胞培养箱为美国热电公司产品；普通PCR扩增仪及荧光实时定量PCR扩增仪均为BIO-RAD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根据GenBank中获得的人的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,一种管家基因)、PTHrP基因序列，并按照实时定量PCR引物设计要求设计特异性引物，分别扩增基因序列中的一小段序列。本试验中所用引物均由大连宝生物工程有限公司合成，序列见表1。

1.2.2 细胞常规培养 用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的RPMI-1640细胞培养基，于37 ℃，5%CO2培养箱中常规培养YTMLC细胞，一般3～4 d，待细胞铺满细胞培养瓶后，按1∶4进行传代，当细胞达到所需用量时，取对数生长期的细胞进行后续试验。

1.2.3 性激素刺激YTMLC细胞 按常规培养，待细胞处于对数生长期时，吸走原来的细胞培养基，用含有10%活性炭处理过血清的无酚红1640培养基轻轻地清洗细胞面两次，再加入2 mL上述培养基，并分别加入相应浓度的17β-雌二醇或睾酮,混匀,使其终浓度分别呈0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 nmol/L浓度梯度，于37 ℃，5%CO2培养箱中继续培养48 h,48 h后进行总RNA的抽提。

表1 引物序列

1.2.4 总RNA抽提 按照RNApure 高纯总RNA快速抽提试剂盒中说明书的操作步骤进行RNA抽提。

1.2.5 逆转录合成cDNA 总的反应体系为20 μL。模板RNA 1.5 μg，随机引物1 μL，补去nuclease H2O至12 μL，5×反应缓冲液4 μL，RNase 抑制剂(20 U/μL)1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，M-MuLV 反转录酶(200 U/μL)1 μL，混匀。25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min在普通PCR仪中进行逆转录，合成好的cDNA可以直接进行后续试验或者冻存于-80 ℃备用。

1.2.6 EvaGreen实时定量PCR

1.2.6.1 扩增反应体系 总体系为25.0 μL。EvaGreen supermix 12.5 μL，cDNA 5.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，dH2O 5.5 μL。实际操作过程中，根据试验需要可将各组分的比例做相应的调整。加样过程均在冰上进行，加样完成后，轻微振荡混匀后置入实时定量PCR仪中进行循环反应。扩增条件：首先95 ℃ 3 min,其次95 ℃ 15 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,82 ℃ 5 s,读板，共45个循环。之后作熔解曲线，程序如下：95℃ 10 s，65 ℃ 5 s ，之后以0.1 ℃/s的速率缓慢增温到95 ℃，读板。每份样本分别扩增内参基因GAPDH和目的基因PTHrP,且均设两个复孔。

1.2.6.2 PCR产物特异性鉴定 扩增反应结束后，分析PCR熔解曲线，确定产物的特异性，如果出现一个峰，则PCR扩增产物特异，如果出现多峰，则PCR出现非特异性扩增。

1.2.6.3 分析基因表达 扩增反应结束后，PCR仪自动计算出各孔的Ct值。本研究中主要采用△△Ct方法来计算2-△△Ct值，在目标基因和内参基因的扩增效率相同的情况下，通过计算2-△△Ct值得出各样本与对照之间的基因表达的相对倍数变化关系。△△Ct=(Ct样本目的基因-Ct样本内参基因)-(Ct对照目的基因-Ct对照内参基因)。

2 结 果

2.1 实时荧光扩增曲线 用不同浓度的性激素刺激YTMLC细胞48 h，进行荧光定量PCR，分别扩增内参基因GAPDH中的一段和目的基因PTHrP中的一段，得到荧光扩增曲线见图1、2。图中显示，各样本扩增后，具有明显的S型扩增曲线。且各个样本内参基因GAPDH的扩增曲线均在17个循环左右起峰，目的基因PTHrP的扩增曲线均在31个循环左右起峰。PCR仪显示相同样本的内参基因GAPDH和目标基因PTHrP的扩增效率基本一致。

图1 17β-雌二醇刺激XWLC-05细胞后扩增曲线 图2 睾酮刺激XWLC-05细胞后扩增曲线

图3 17β-雌二醇刺激YTMLC后熔解曲线

图4 17β-雌二醇刺激YTMLC后熔解峰

图5 睾酮刺激YTMLC后熔解曲线

图6 睾酮刺激YTMLC后熔解峰

2.2 实时荧光扩增熔解曲线和熔解峰 通过做熔解曲线，得到熔解曲线图和熔解峰，见图3～6。熔解峰显示各反应孔内参基因GAPDH的Tm值均为82.5 ℃，各样本目标基因PTHrP的Tm值均为86.0 ℃。从图中可见每条扩增曲线仅出现一个峰，证明PCR仅生成一种产物，并没有受到引物二聚体的影响。

2.3 基因表达分析 扩增反应结束后，荧光实时定量PCR仪读出各反应孔的Ct值，通过△△Ct方法来计算2-△△CT值，得到基因相对表达倍数图谱。从图7中可以明显看出，受不同浓度17β-雌二醇刺激YTMLC 48 h后,PTHrP的表达相对于没有受17β-雌二醇刺激的细胞来说，并无明显变化。但是图8显示，YTMLC在受不同浓度的睾酮刺激作用48 h后，相对于没有受睾酮刺激的细胞，PTHrP的表达倍数随着睾酮浓度的升高而降低，10 nmol/L睾酮作用时，PTHrP的相对表达量只有没受睾酮刺激细胞表达量的20%左右。

图7 不同浓度的雌二醇刺激YTMLC后PTHrP基因的表达

图8 不同浓度的睾酮刺激XWLC-05细胞后PTHrP基因的表达

3 讨 论

PTHrP最早于1987年发现于恶性肿瘤伴发的高钙血症患者的血浆中，主要由肿瘤组织和细胞产生和分泌，包括鳞状细胞癌，泌尿系统癌，乳腺癌，卵巢癌等组织和细胞都能产生PTHrP。正常组织和细胞仅能表达极少量的PTHrP，常规的检测方法几乎无法检测得[12-13]。人的PTHrP由141个氨基酸组成，比PTH长2倍左右，相对分子质量为16×103，其中N端的1-34个氨基酸与PTH N端地1-34个氨基酸序列和结构相同，是与PTH受体结合并发挥类似PTH作用的部位[14]。目前普遍认为PTHrP是引起恶性肿瘤高钙血症的主要致病因素，PTHrP作为骨吸收刺激因子(BRSF)的一种，能够作用于成骨细胞，与PTH受体结合，通过激活腺苷酸环化酶，增加cAMP的产生，通过cAMP的介导作用间接促进破骨细胞引起骨吸收，使钙由骨入血[15]。此外，PTHrP还能促进肾小管对Ca的吸收，综合这些作用引起高钙血症。大量的研究工作已经证实，PTHrP同样是导致肺癌患者发生高钙血症的主要因素，但揭示其在肺癌的进展或判断预后方面的工作还很少。随着人们对PTHrP认识的深入，近年来，国外的一些研究结果提示，在肺癌中PTHrP的表达是一个有益的预后因子，它在延迟肿瘤的生长，延长患者的生存期方面具有重要影响，尤其是对于女性肺癌患者来说，PTHrP是一个非常有意义的预测指标。由于肺鳞癌是肺癌中最为常见的一种临床类型，它的发病率在各种肺癌中最高。因此本研究中选用肺鳞癌细胞作为研究对象，通过不同雌性激素17β-雌二醇和雄性激素睾酮分别作用于肺鳞癌细胞YTMLC，采用EVA荧光实时定量PCR技术检测PTHrP的相对表达量。结果显示，17β-雌二醇对肺鳞癌细胞中PTHrP的表达量并无明显的调节作用，而睾酮对其起到明显的负调节作用;随着睾酮浓度的增加，PTHrP的表达量依次减少。可见性激素水平对肺鳞癌细胞中PTHrP基因表达的影响作用，监测其水平可以作为判断肺癌患者预后的依据。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[2]姚晓军,刘伦旭.肺癌的流行病学及治疗现状[J].现代肿瘤医学,2014,22(8):1982-1986.

[3]Ou SH.Republished:lung cancer in never-smokers.Does smoking history matter in the era of molecular diagnostics and targeted therapy?[J].Postgrad Med J,2014,90(162):228-235.

[4]袁利华,杨树民.烟草对女性的危害及应对措施[J].浙江预防医学,2015,27(6):572-576.

[5]Sourbier C,Massfelder T.Parathyroid hormone-related protein in human renal cell carcinoma[J].Cancer Lett,2006,240(2):170-182.

[6]Wysolmerski JJ.Parathyroid hormone-related protein[M].Endocrinology:Adult and Pediatric,2016:215-223.

[7]Lozano D,Sánchez-Salcedo S,Portal-Núez S,et al.Parathyroid hormone-related protein (107-111) improves the bone regeneration potential of gelatin-glutaraldehyde biopolymer-coated hydroxyapatite[J].Acta Biomaterialia,2014,10(7):3307-3316.

[8]Martin TJ,Moseley JM,Gillespie MT.Parathyroid hormone-related protein:biochemistry and molecular biology.[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2015,26(3/4):377-395.

[9]Bakre MM,Zhu Y,Yin H,et al.Parathyroid hormone-related peptide is a naturally occurring,protein kinase A-dependent angiogenesis inhibitor[J].Nat Med,2002,8(9):995-1003.

[10]Dougherty KM,Blomme EA,Koh AJ,et al.Parathyroid hormone-related protein as a growth regulator of prostate carcinoma[J].Cancer Res,1999,59(23):6015-6022.

[11]曹宏,刁路明,夏东.姜黄素与顺铂联合对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡作用[J].武汉大学学报(医学版),2008,29(2):213-217.

[12]Montgrain PR,Deftos LJ,Arenberg D,et al.Prognostic implications of parathyroid hormone-related protein in males and females with non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer,2011,12(3):197-205.

[13]Montgrain PR,Quintana R,Rascon Y,et al.Parathyroid hormone-related protein varies with sex and androgen status in nonsmall cell lung cancer[J].Cancer,2007,110(6):1313-1320.

[14]Zheng HL,Li H,Sun YS,et al.Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP):prokaryotic expression,purification,and preparation of a polyclonal antibody[J].Genet Mol Res,2014,13(3):6448-6454.

[15]Matsuo T,Dat le T,Komatsu M,et al.Early growth response 4 is involved in cell proliferation of small cell lung cancer through transcriptional activation of its downstream genes[J].PLoS One,2014,9(11):e113606.

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.041

陈晓露(1977-)，副教授，本科，主要从事病理学方面研究。△

，E-mail:stop--stop@163.com。

R734.2

B

1671-8348(2017)14-1988-03

2017-01-21

2017-03-09)