以马唐为主要原料的丝状真菌培养基研究

李健+李美+高兴祥+房锋+董连红

摘要：

我国杂草资源丰富，研究以杂草为基础的微生物发酵培养基，对有效利用杂草资源、降低微生物发酵成本具有重要意义。本研究筛选了一种以杂草马唐（Digitaria sanguinalis）为主要原料适宜丝状真菌液体发酵培养的优良培养基——马唐葡萄糖培养基（DDM），并研究了其适宜培养温度、pH，产孢量和产孢速率。结果显示，供试3种丝状真菌均可在DDM培养基上迅速产生大量孢子，在该培养基内供试镰刀菌菌株培养3 d后产孢量约为传统马铃薯葡萄糖培养基的1.6倍，培养5 d即可达到产孢高峰；在真菌常规培养温度和适宜pH范围内供试丝状真菌均可在DDM培养基上正常生长和产孢。该培养基相较于目前在丝状真菌培养中应用比较广泛的培养基，在产孢速率和产孢量方面有较为显著的优势，有利于降低丝状真菌培养成本和缩短培养时间。

关键词：丝状真菌；培养基；马唐；菌丝重量；产孢量；成本

中图分类号：S451文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）05-0097-05

An Efficient Medium Containing Digitaria sanguinalis

for Filamentous Fungi Culture

Li Jian， Li Mei， Gao Xingxiang， Fang Feng， Dong Lianhong

（Institute of Plant Protection，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China）

AbstractChina is rich in grass resources. The research on microbial fermentation medium using weeds as raw material can not only reduce the cost of microbial fermentation， but also improve the weed resource utilization. In this paper， we provided an efficient Digitaria sanguinalis dextrose medium （DDM） containing Digitaria sanguinalis for filamentous fungi culture， and studied the optimal culture temperature， pH value， sporulation quantity and sporulation rate. The results showed that the DDM medium was significantly better than other weed culture medium in the sporulation quantity. The sporulation quantity of Fusarium strain in DDM medium was about 1.6 times of that in PD medium after cultured for 3 days， and reached the peak after cultured for 5 days. The tested strains were able to grow normally and produce spores in the DDM under the conventional culture temperature and pH range. Compared with the media widely used in filamentous fungi culture， the DDM had more obvious advantages in sporulation rate and quantity， and was benefit to reducing cost and culture time.

KeywordsFilamentous fungi； Culture medium； Digitaria sanguinalis； Mycelial weight； Sporulation quantity； Cost

絲状真菌（filamentous fungi）是一类在自然界中广泛分布的真菌微生物，可以通过无性孢子如分生孢子和厚垣孢子进行无性繁殖[1]。丝状真菌与农业、工业和生物医药等多个领域存在着广泛联系[2，3]。例如，一些优良菌株被应用于工业生产生物酶、生物激素和有机酸等物质[3，4]；农业中许多作物的病害都由丝状真菌侵染造成，如小麦赤霉病（Fusarium headblight）[5，6]、水稻稻瘟病（rice blast）等；多种丝状真菌被筛选出来用于生物防治领域，例如利用画眉草弯孢霉（Curvularia eragrostidis J.A.Meyer）进行杂草马唐的防治[7]。同时由于丝状真菌的广泛代表性，往往会被筛选出来作为“模式生物”进行广泛研究[8]，例如对稻瘟菌（Magnaporthe grisea）[9]和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）[10]的研究。

获得无性孢子或次级代谢产物是大多数丝状真菌发酵的最终目的[11]，而这一过程伴随着大量液体培养基的使用。因此，丝状真菌高效培养基的筛选对于该类真菌的研究和开发具有重要意义。低廉的原料成本是发酵培养基能够应用的重要基础[12]。目前，丝状真菌液体发酵培养基原料主要以粮食作物，例如小麦、玉米、大豆和马铃薯等为应用原料，或以化学试剂为主要原料，例如葡萄糖、蛋白胨和酵母浸粉等[13]。截至目前，对以田间杂草为原料的微生物培养基研究较少。而草本植物内生微生物资源丰富，例如甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的内生真菌就多达11个属[14]。杂草体内的真菌，能够以杂草为营养来源完成生长过程，表明多种杂草可被开发为广适性真菌培养基材料。

我国田间杂草资源丰富，目前对于农田杂草大都采用化学防除的方法[15-17]，而对于防除后残留在农田里、田间地头和非耕地的杂草则缺乏回收利用方法，杂草利用率极低，造成了大量生物质资源的浪费。因此，研究以杂草为基础的微生物发酵培养基，最大化地开发杂草资源，减少浪费，对于优化微生物培养基组成、降低配制成本都有重要意义。

1材料与方法

1.1材料

供试丝状真菌菌株：F1：稻瘟菌（Magnaporthe grisea）；F2：胶孢炭疽菌（Colletotrichum spp.）；F3：厚垣孢镰刀菌（Fusarium spp.）。

供试马唐：其种子为本实验室采集并保存，并通过温室种植获得马唐植株。

1.2培养基配置

供试培养基：主要成分为马唐和葡萄糖，将其命名为马唐葡萄糖培养基（Digitaria sanguinalis dextrose medium，DDM）。取试验需要用量马唐，对材料进行人工切碎，至茎叶片段小于5 cm，沸水煮30 min，纱布过滤得到汁液。液体中加入试验需要用量葡萄糖和磷酸二氢钾0.5 g，溶解后定容至1 L，根据所培养菌株的特性调节pH。将定容后的溶液于121℃、1.05×105 Pa下灭菌锅灭菌20 min，备用。

马铃薯葡萄糖培养基（PD）：马铃薯200 g，人工切成约2 cm×2 cm的块，沸水煮30 min，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入葡萄糖20 g，并定容至1 000 mL。将定容后的溶液于121℃、1.05×105 Pa下灭菌锅灭菌20 min，备用。

胡萝卜培养基（CA）：胡萝卜200 g，人工切成约2 cm×2 cm的块，沸水煮30 min，纱布过滤，留取汁液。加水并定容至1 000 mL。将定容后的溶液于121℃、1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20 min，备用。

葡萄糖蛋白胨培养基（DP）：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加水定容至1 000 mL。将定容后的溶液于121℃、1.05×105 Pa下灭菌锅灭菌20 min，备用。

1.3丝状真菌在DDM培养基上的培养试验

1.3.1不同配比DDM培养基筛选以马唐和葡萄糖为培养基的主要原料，采用完全随机试验设计，对培养基内添加的马唐和葡萄糖进行梯度筛选。分别设置马唐含量为50、100、150、200 g/L共4个梯度和葡萄糖含量为2.5、5.0、10.0 g/L共3个梯度进行DDM培养基的配制，测定12个不同配比下丝状真菌的生长情况。具体配比见表1。

将供试丝状真菌菌株F3用PDA培养基活化，5 d后在生长一致的菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，接种到100 mL各供试培养基中（500 mL培养瓶），放置于摇床内，180 r/min、25℃、黑暗培养。自第3 d始，每天取出3瓶，摇匀后吸取一定量液体，血球计数板计数孢子数量；双层纱布过滤收集菌丝，80℃烘箱烘烤2 h后称量菌丝干重，统计菌丝量。重复3次。

1.3.2DDM培养基与常用真菌培养基的比较配制1.3.1筛选出的适宜配比的DDM培养基，与目前常用的丝状真菌产孢培养基（PD、CA、DP）进行菌株培养对比试验。培养基pH值统一调为7.0，供试菌株为镰刀菌F3。按1.3.1中丝状真菌的活化、接种、培养方式对F3菌株进行培养，并统计菌丝和产孢量。重复3次。

1.3.3多種丝状真菌在DDM培养基内的生长状况比较配制1.3.1筛选出的适宜配比的DDM培养基， pH值调为7.0，选取3种丝状真菌（F1：稻瘟菌；F2：胶孢炭疽菌；F3：厚垣孢镰刀菌）为供试菌株，按1.3.1中丝状真菌的活化、接种、培养方式对供试菌株进行培养，并统计菌丝和产孢量。重复3次。

1.3.4丝状真菌在DDM培养基和常用真菌培养基内的适宜培养温度比较将供试F3菌株接种到1.3.1筛选的适宜配比的DDM培养基及目前常用的丝状真菌产孢培养基（PD、CA、DP）内，培养基pH值统一调为7.0，将温度条件设置为16、19、22、25、28、31℃，测定待测真菌在该培养基中的最适培养温度。培养及统计方法同1.3.1。重复3次。

1.3.5丝状真菌在DDM培养基和常用真菌培养基中的适宜培养pH值比较将供试F3菌株接种到1.3.1筛选的适宜配比的DDM培养基及目前常用的丝状真菌产孢培养基（PD、CA、DP）内，将各培养基pH值调制成5、6、7、8、9、10，培养及统计方法同1.3.1。重复3次。

1.3.6丝状真菌在DDM培养基和常用真菌培养基中的产孢速率比较以供试菌株F3为测试菌株，以1.3.1筛选的适宜配比的DDM培养基为测试培养基，以PD培养基为对照，在振荡培养过程中分别于第2、3、4、5、6、7 d取3个培养瓶，记录菌丝重量和产孢量。

1.4数据分析

所得数据用SPSS 16.0软件进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1DDM培养基的适宜配比筛选

表1结果显示，当马唐含量在100 g/L及以上、葡萄糖含量在5 g/L及以上时，菌丝干重和产孢量之间无显著差异，真菌培养效果均较佳。从表1还可以看出，马唐含量对菌丝和分生孢子产量构成主要影响，葡萄糖影响相对于马唐较小，但是仍然对真菌生长和分生孢子产量构成影响。综合分析，本研究筛选出的DDM培养基适宜马唐含量为100 g/L，葡萄糖含量为5 g/L。

2.2DDM培养基与多种真菌培养基的比较

表2结果显示，DDM培养基内F3菌丝干重与PD、DP培养基差异不显著，均显著高CA培养基；产孢量最高，显著高于其它常用培养基，约为PD培养基的1.6倍。可见，DDM培养基相较于其它在镰刀菌培养中应用比较广泛的培养基，在分生孢子产量方面有较为显著的优势。

2.4丝状真菌在DDM培养基上的适宜培养条件

培养基内营养成分不因外界环境的改变而发生活性改变是对其能够应用的基本要求。而环境温度和培养pH值是真菌培养过程中两个重要影响因素。不同温度和pH条件下菌株生长检测结果（表4）显示，镰刀菌在DDM培养基上在16～31℃温度范围内均可生长，且以25～31℃产孢量较大，均显著高于其它较低温度；其生长趋势和PD培养基较为一致，且在19～31℃产孢量均优于PD培养基。说明，在真菌常规培养温度下DDM培养基能够正常使用，且优于真菌常规培养基。

结果（表5）显示，在DDM培养基内，镰刀菌在pH 5～10均可生长，且以pH 6～8之间生长较好，这与供试菌株在PD培养基内的生长习性基本一致。说明，在适宜培养pH范围内丝状真菌在DDM培养基上能够正常生长和产孢。

2.5丝状真菌在DDM培养基内的产孢量

由表6可知，供试镰刀菌菌株在DDM培养基内，随着培养时间的延长，产孢量逐渐增加，但培养5～7 d内差异不显著，即在接种培养5 d后达到产孢高峰。说明，相较PD培养基，镰刀菌菌株在DDM培养基内产孢量更高，达到对数生长期

值的时间更短。

3讨论与结论

马唐是世界上分布最为广泛的18种恶性杂草之一[18]，其生长迅速，是我国黄淮海地区玉米田的主要优势杂草。我国每年由杂草造成的经济损失巨大[19]，且缺乏对杂草资源的有效利用方式，造成了大量生物质资源的浪费[20]。目前微生物培养基主要原料物质为作物或合成化学物质，成本相对较高。开展以杂草为主要原料的微生物培养基，不仅有助于解决杂草资源的浪费问题，同时有助于降低微生物培养成本。

目前以植物病原真菌和以丝状真菌的研究为基础的生物防治工作越来越普遍，对相应培养基的需求也越来越高。复杂多样的微生物，对相应培养基的要求也不同[21]。而一种优质、低廉和易制备的培养基对于生防真菌的研究至关重要。研究显示，在禾本科杂草内存在大量、多种类的内生真菌，例如醉马草（Achnatheru minebrians）[22]、狗牙根（Cynodon dactylon）和甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）[14]等。这类真菌能够通过从寄主禾本科杂草内获得营养物质以完成其大部分或全部的生命周期，并对增强禾本科杂草逆境适应性有一定作用[23，24]。禾本科杂草内生真菌的多样性存在，也说明禾本科杂草具有作为营养物质供广适性真菌生长的基础。这也为开发以杂草为基础的微生物培养基提供了理论基础。在此基础上，本文以杂草马唐为主要原料，研究了一种适宜于丝状真菌液体发酵的培养基，进一步研究显示，该培养基可广泛应用于多种丝状真菌的培养，且产孢速度快。

微生物培养过程中伴随着一定的生物代谢过程，可能导致培养基内pH值等条件的改变，因此环境条件适应范围广等是微生物培养基开发应用的主要条件之一[21]。本培养基内的杂草马唐制备获取简单，且在较宽的培养温度和培养pH范围内均能进行正常的丝状真菌培养。说明禾本科杂草马唐具有被开发为微生物培养基原料的潜能，这为研究以杂草为基础的微生物培养基提供了依据。

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