ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌中的表达及临床意义

曾 伟, 高 鹏, 朱小三, 戴益琛, 陈章兴, 谢军培, 詹晓娟, 张 如

解放军第一七四医院 1.消化内科; 2.病理科, 福建 厦门 361003

ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌中的表达及临床意义

曾 伟1, 高 鹏1, 朱小三1, 戴益琛1, 陈章兴1, 谢军培1, 詹晓娟1, 张 如2

解放军第一七四医院 1.消化内科; 2.病理科, 福建 厦门 361003

目的 探讨ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌中的表达特点与预后的关系。方法 采用免疫组化方法检测17例胆管癌及其癌旁正常胆管组织中ECHS1和PKM2蛋白的表达情况，并分析两种蛋白表达与胆管癌临床病理特征及预后的关系。结果 ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌组织中的阳性率分别为58.8%和64.7%，高于癌旁组织中的阳性率17.9%和21.4%，差异有统计学意义(P<0.05)；ECHS1和PKM2 蛋白与胆管癌患者性别、年龄及肿瘤直径无相关性，而与胆管癌分化程度、TNM分期及生存时间有相关性。结论 ECHS1和PKM2蛋白表达水平与胆管癌发生、发展及转移关系密切。

胆管癌；ECHS1；PKM2；预后

胆管癌是胆管常见的恶性肿瘤，起源于胆管上皮细胞，可以发生在胆管的任何部位，就发病率而言，胆管癌的发病率居第2位[1]。胆管癌起病隐匿，早期检测困难；手术切除率低，难以根治，我国近年的治愈率仅为18.0%～26.2%；且远期疗效不佳，术后复发率高，病死率高；临床药物治疗过程中易出现抗药性[2]。近年报道在全球范围内，胆管癌，尤其是肝外胆管癌的发病率及病死率均呈上升趋势[3]。建立有效的早期检测，寻找有效的药物作用靶点，开发出新的药物并应用于临床的需求比较迫切。虽然目前胆管癌发生、发展的研究较为深入，寻找到了一些有价值的基因和分子，但是尚未发现药物相关的作用靶点，同时，还有较多基因和分子有待深入了解。我们认为，在分子水平上，对胆管癌的发生和发展作进一步研究，将有利于胆管癌的早期检测和药物开发，为临床治疗提供有价值的信息。ECHS1和PKM2在多种恶性肿瘤组织中高表达，与肿瘤恶性程度和患者预后密切相关。本研究中我们应用免疫组化技术检测ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌组织中的表达情况，探讨其表达差异与临床意义。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集2011年1月-2015年5月解放军第一七四医院手术切除的17例胆管癌患者肿瘤组织及其相应癌旁正常胆管黏膜组织(距肿瘤组织5 cm以上)标本。所有患者术前均未行放化疗。其中男11例，女6例，年龄40～80岁。标本离体后，一部分立即置入液氮罐，储存于-80 ℃冰箱中备用；另一部分标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，病理证实为胆管细胞癌。

1.2 随访情况 通过门诊、电话和信访等方式进行随访，记录性别、年龄、病理类型和临床分期(以1997年国际抗癌联盟的分期为标准)。最长随访至25个月，中位随访时间16个月，随访率为98.9%。总生存期(overall survival, OS)的计算为病理确诊开始至死于任何疾病、最后随诊日期或截止观察日期。

1.3 免疫组化检测[4]采用SP法检测ECHS1和PKM2蛋白表达，抗原修复液为枸橼酸缓冲液(pH 6.0)。染色结果根据阳性对照和阴性对照情况，按每张切片的阳性细胞数比例进行定性分析。阳性细胞<30%为阴性，≥30%为阳性。采用已知有PKM2表达的胆管癌标本作为阳性对照，在阳性对照的空白切片中以PBS代替抗PKM2作为阴性对照。由病理科2名医师在不知临床资料的情况下对标本染色结果进行评估。ECHS1蛋白在细胞质和(或)细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，PKM2在细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每个视野计数200个细胞，共计5个高倍视野的阳性细胞数，确定阳性细胞百分率<25%蛋白表达为(-)，25%～49%为(+)，50%～74%为(++)，>75%为(+++)，阳性细胞百分率≥25%确定为蛋白表达阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计数资料的比较采用卡方检验，采用Kaplan Meier法进行生存分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌组织中的表达情况 ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌组织中均呈高表达；ECHS1蛋白表达定位于细胞质，呈棕色至褐色，PKM2蛋白表达定位于细胞浆及细胞核内，均呈棕黄色(见图1～2)。ECHS1蛋白在胆管癌及正常胆管组织中阳性表达率分别为58.8%和17.9%，PKM2蛋白在两组中的阳性表达率分别为64.7%和21.4%，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 ECHS1蛋白在胆管癌组织中阳性表达(400×);图2 PKM2蛋白在胆管癌组织中阳性表达(400×)

Fig 1 ECHS1 protein was positive in cholangiocarcinoma(400×); Fig 2 PKM2 protein was positive in cholangiocarcinoma (400×)

2.2 ECHS1和PKM2蛋白与胆管癌临床病理特征的关系 胆管癌组织中ECHS1和PKM2蛋白的表达与患者性别、年龄及肿瘤直径均无相关性(P>0.05)，而与胆管癌细胞分化程度、TNM分期以及生存时间有相关性(P<0.05，见表1)。

表1 ECHS1和PKM2蛋白表达与胆管癌临床病理特征关系
Tab 1 Relationship between expressions of ECHS1 and PKM2 proteins and clinicopathological characteristics of cholangiocarcinoma

临床病理特征例数ECHS1蛋白[n(%)]阳性阴性χ2值P值PKM2蛋白[n(%)]阳性阴性χ2值P值性别 男116(54.5)5(45.5)2.0710.8047(63.6)4(36.4)2.0460.592 女64(66.7)2(33.3)4(66.7)2(33.3)年龄(岁) <4586(75.0)2(25.0)1.2480.8036(75.0)2(25.0)0.2910.705 ≥4594(44.4)5(55.6)5(55.6)4(44.4)肿瘤直径(cm) <2.0107(70.0)3(30.0)1.7360.6187(70.0)3(30.0)2.9030.611 ≥2.073(42.9)4(57.1)4(57.1)3(42.9)肿瘤分化程度 中-高分化85(62.5)3(37.5)7.3160.0165(62.5)3(37.5)9.0120.024 低分化95(55.6)4(44.4)6(66.7)3(33.3)TNM分期 Ⅰ～Ⅱ53(60.0)2(40.0)8.0360.0153(60.0)2(40.0)9.3140.016 Ⅲ～Ⅳ127(58.3)5(41.7)8(66.7)4(33.3)生存时间(月) ≥12106(60.0)4(40.0)7.9810.0236(60.0)4(40.0)9.4830.015 <1274(57.1)3(42.9)5(71.4)2(28.6)

3 讨论

即使在有氧条件下，恶性肿瘤细胞糖酵解代谢仍明显活跃，也经由糖酵解转化大量葡萄糖生成乳酸。这一特殊生化表型，被称为瓦博格效应(Warburg effect)[5]。PKM2及ECHS1分别是催化糖酵解及脂肪酸分解代谢β氧化通路的关键酶，传统认为它们的异常表达可导致一系列代谢性疾病，如婴儿猝死综合征和瑞氏综合征等[6-7]。但最近研究发现PKM2及ECHS1表达异常与多种恶性肿瘤发生、发展关系密切[8-9]。袁素娟等[10]研究发现特异性沉默PKM2基因表达能够增加A549细胞的放射敏感性，推测其机制可能与改变细胞周期分布及射线诱导细胞凋亡的作用增强有关。PKM2基因在肝癌组织中高表达；在单羧酸转运蛋白4高表达的肝癌细胞中敲除PKM2基因，可以显著抑制肝癌细胞生长，提示PKM2通过调节糖代谢而影响肿瘤细胞的生长[11]。在乳腺癌中，PP2能诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡，并下调ECHS1和PRDX3表达，如果上调ECHS1则可以减少细胞的凋亡[12]。在胃癌细胞中研究发现，过表达ECHS1能促进淋巴结转移，下调则可以抑制细胞的侵袭与迁移作用[13]。这些研究显示，PKM2及ECHS1可能与肿瘤的生长和转移有关。

目前有关PKM2及ECHS1在胆管癌中调控特点的研究甚少，因此本研究进行了试验性探索，拟为胆管癌诊断及治疗提供新途径。本研究结果显示，在癌旁组织中PKM2蛋白和ECHS1蛋白表达阳性率分别为21.4%和17.9%，但在胆管癌组织中PKM2蛋白和ECHS1蛋白的表达阳性率分别为64.7%和58.8%，均显著高于癌旁组织中的表达，提示胆管癌的发生可能与PKM2和ECHS1蛋白的异常高表达有关。本研究分析了胆管癌组织中PKM2蛋白和ECHS1蛋白的表达与其临床病理特征的关系，结果发现：PKM2蛋白和ECHS1蛋白在胆管癌组织中的表达与患者性别、年龄及肿瘤大小均无相关性，而与肿瘤分化程度、TNM分期及患者生存时间均有关。PKM2蛋白和ECHS1蛋白在低分化癌中的表达阳性率最高，中高分化癌次之；在淋巴结转移阳性癌组织中表达阳性率高，而淋巴结转移阴性癌组织中表达阳性率低；在Ⅲ～Ⅳ期胆管癌组织中表达阳性率高，而Ⅰ～Ⅱ期癌组织中表达阳性率低。另外，本研究还分析了胆管癌组织中PKM2和ECHS1蛋白表达与患者生存时间的关系，结果发现，PKM2蛋白和ECHS1蛋白表达高的患者相对低表达患者生存期较长。

综上所述, PKM2和ECHS1蛋白的表达在胆管癌发生、发展过程中发挥重要作用，其具体作用机理还需要进行大样本的研究来证实。

[1]Sribenja S, Natthasirikul N, Vaeteewoottacharn K, et al. Thymosin β10 as a predictive biomarker of response to 5-fluorouracil chemotherapy in cholangiocarcinoma [J]. Ann Hepatol, 2016, 15(4): 577-585.

[2]Wang B, Chen L, Chang HT. Potential diagnostic and prognostic biomarkers for cholangiocarcinoma in serum and bile [J]. Biomark Med, 2016, 10(6): 613-619.

[3]Kaewpitoon SJ, Rujirakul R, Loyd RA, et al. Surveillance of populations at risk of cholangiocarcinoma development in rural communities of thailand using the Korat-CCA verbal screening test [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2016, 17(4): 2205-2209.

[4]Takada K, Toyokawa G, Okamoto T, et al. An immunohistochemical analysis of PP-L1, protein expression in surgically resected small cell lung cancer using different antibodies and criteria [J]. Anticancer Res, 2016, 36(7): 3409-3412.

[5]Vamecq J, Colet JM, Vanden Eynde JJ, et al. PPARs: Interference with Warburg’ effect and clinical anticancer trials [J]. PPAR Res, 2012, 2012: 304760.

[6]Xie JP, Zhu XS, Dai YC, et al. Expression of enoyl coenzyme A hydratase, short chain, 1, in colorectal cancer and its association with clinic pathological characteristics [J]. Mol Clin Oncol, 2014, 2(6): 1081-1084.

[7]Zhang J, Song M, Wang J, et al. Enoyl coenzyme A hydratase 1 is an important factor in the lymphatic metastasis of tumors [J]. Biomed Pharmacother, 2011, 65(3): 157-162.

[8]Dong G, Mao Q, Xia W, et al. PKM2 and cancer: The function of PKM2 beyond glycolysis [J]. Oncol Lett, 2016, 11(3): 1980-1986.

[9]朱小三, 戴益琛, 陈章兴, 等. 烯脂酰辅酶A水合酶短链1促进肝癌HepG2细胞的增殖[J].肿瘤, 2013, 33(05): 422-427. Zhu XS, Dai YC, Chen ZX, et al. Enoyl-coenzyme A hydratase, short chain 1 involved in promoting the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2 cells [J].Tumor, 2013, 33 (5): 422-427.

[10]袁素娟， 乔田奎， 庄喜兵， 等. PKM2基因沉默对人肺癌A549细胞放射敏感性的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志， 2015， 35(6)： 428-432. Yuan SJ, Qiao TK, Zhuang XB, et al. Blockage of PKM2 expression by gene silencing enhances the radiosensitivity of human lung cancer A549 cells [J]. Chin J Radiol Med Prot, 2015, 35(6): 428-432.

[11]Jung Y, Jang YJ, Kang MH, et al. Metabolic signature genes associated with susceptibility to pyruvate kinase, muscle type 2 gene ablation in cancer [J]. Mol Cells, 2013, 35(4): 335-341．

[12]Liu X, Feng R, Du L. The role of enoyl-CoA hydratase short chain 1 and peroxiredoxin 3 in PP2-induced apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells [J]. FEBS Lett, 2010, 584(14): 3185-3192.

[13]Zhu XS, Gao P, Dai YC, et al. Attenuation of enoyl coenzyme A hydratase short chain 1 expression in gastric cancer cells inhibits cell proliferation and migration in vitro [J]. Cell Mol Biol Lett, 2014, 19(4): 576-589.

(责任编辑：李 健)

Expressions of ECHS1 and PKM2 proteins in cholangiocarcinoma and the clinical significance

ZENG Wei1, GAO Peng1, ZHU Xiaosan1, DAI Yichen1, CHEN Zhangxing1, XIE Junpei1, ZHAN Xiaojuan1, ZHAN Ru2

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, the 174th Hospital of PLA, Xiamen 361003, China

Objective To investigate the expressions and clinical significance of ECHS1 and PKM2 proteins in cholangiocarcinoma.Methods The expressions of ECHS1 and PKM2 in cholangiocarcinoma tissues and paracancerous normal bile duct tissues were detected. The relationship of expressions of ECHS1 and PKM2 proteins with clinical pathology features and prognosis of cholangiocarcinoma were analyzed.Results The positive rates of ECHS1 and PKM2 proteins were significantly higher in cholangiocarcinoma than those in normal tissues (58.8%vs17.9%, 64.7%vs21.4%,P<0.05). The expressions of ECHS1 and PKM2 proteins in cholangiocarcinoma were not related with sex, age and tumor size (P>0.05). However, they were related with the differentiation grade, TNM stage and postoperative survival time (P<0.05)．Conclusion Both ECHS1 and PKM2 poteins may play important roles in the occurrence and development of cholangiocarcinoma．

Cholangiocarcinoma; ECHS1; PKM2; Prognosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.025

2016年厦门市科技计划项目(3502Z20164045); 2015年南京军区医学科技创新课题(15MS099)

曾伟，医学硕士，主治医师，研究方向：胆管癌基因诊断与治疗。E-mail: weizeng2166@163.com

戴益琛，医学博士，教授，研究方向：消化系统肿瘤基础与临床研究。E-mail: dyichen@sina.com

R735.8

A

1006-5709(2017)05-0570-03

2016-09-13