心理应激对肠易激综合征模型大鼠肠黏膜孤啡肽受体表达的影响

王 鑫，巨 伟，李武良，李 萍，李 鑫

西安市第九医院消化内科，陕西 西安 710054

心理应激对肠易激综合征模型大鼠肠黏膜孤啡肽受体表达的影响

王 鑫，巨 伟，李武良，李 萍，李 鑫

西安市第九医院消化内科，陕西 西安 710054

目的 检测心理应激对肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)大鼠肠黏膜孤啡肽受体(ORL-1)mRNA和蛋白表达水平，初步探讨心理应激对IBS大鼠的影响。方法 80只SD雌性大鼠随机分为对照组和实验组，每组40只，实验组采用束缚应激的方法制作IBS动物模型，并对模型进行鉴定。实验0、1、2、3、4周时两组分别随机取出8只大鼠，在近端结肠(距回盲部2 cm)处取2块黏膜，采用荧光定量PCR法检测ORL-1 mRNA的相对表达量，同时用Western blotting的方法检测ORL-1蛋白，动态观察各组大鼠的表达变化。结果 与对照组相比，实验组大鼠ORL-1 mRNA及蛋白表达水平均升高(P<0.05)，应激1周时最高，2～4周逐渐下降。实验组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。结论 慢性心理应激引起大鼠IBS的发生机制可能与其影响大鼠肠道肠黏膜孤啡肽受体(ORL-1)mRNA及蛋白表达量相关。

心理应激；肠易激综合征；孤啡肽受体；荧光定量PCR法；Western blotting

目前肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是临床上最常见的胃肠功能紊乱性疾病，其主要病理生理基础是胃肠道无器质性病变而感觉动力异常。有研究认为胃肠动力障碍性疾病与肠神经系统的变化密切相关，IBS与肠神经系统的关系被认识，因此，近年来，把IBS当成一种心身性疾病来研究已成为焦点。心理性应激是引起肠神经系统异常的一种方式，消化道的部位不同，影响的结果也有所不同，但大量的研究已经证明：心里应激使结肠的运动显著性加强[1-3]。

孤啡肽又称痛敏素，体内广泛分布，在中枢神经系统及消化道内都能检测到，发挥重要的神经内分泌调节作用。在痛觉调控方面，孤啡肽具有抗阿片的效应，在脑室注射孤啡肽后会产生异常疼痛以及疼痛敏感性增加，而其在脊髓中的作用却能加强阿片镇痛。有关OFQ的研究大多集中于它在痛觉调控方面的作用，也有研究证明：在胃肠道功能的调节方面OFQ也有至关重要的作用，能够有效刺激结肠收缩，加速结肠转运，因而与结肠动力紊乱的发生密切相关，同时很可能参与了应激状态下消化系统的调节[4-6]。但OFQ及其受体在IBS发生中具有怎样的作用，目前相关研究尚少见报道。本次研究主要明确慢性心理应激对大鼠肠道肠黏膜孤啡肽受体(ORL-1)表达的影响，旨在探讨其在IBS发病机制中的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体质量为200～220 g清洁级Sprague-Dawley雌性大鼠80只，在本实验室适应性喂养1周，恢复各项生理正常指标。大鼠喂养混合饲料，在自然光线、安静、室温(18～20 ℃)、昼夜循环12/12 h条件下饲养。

1.2 分组与造模 实验组和对照组各40只大鼠，根据应激时间随机分为0、1、2、3、4周组，每组8只。将实验组大鼠置于自制束缚器内，3 h/d，限制活动，不固定具体的每天束缚时间，并在束缚时间内禁食、禁水；同一时间，对照组大鼠也禁食、禁水，但可以自由活动。实验过程中无大鼠死亡。在大鼠近端结肠(距回盲部2 cm)取2块黏膜活检。黏膜标本取材后立刻放于液氮内，随后转入超低温冰箱-80 ℃保存，准备用于后续实验。

1.3 主要试剂及仪器 TrizolReagant RNA提取试剂盒购自Aidlab公司，逆转录试剂盒购自VAZYME公司，引物设计参照文献，由北京擎科生物公司合成，荧光染料PCR试剂盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix公司。ABI实时荧光定量PCR仪(Viia7)。

1.4 总RNA提取 将组织样本加入1 ml Trizol试剂，匀浆器研磨成浆，移至无RNase的1.5 ml离心管中，裂解10 min，然后加入200 μl氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温静置5 min。4 ℃，12 000 r/min，离心15 min后可见分成上(RNA)中(蛋白)下(DNA)三相。转移上层水相(约400 μl)于另一新1.5 ml离心管中，加入400 μl异丙醇，混匀后室温静置10 min。离心10 min，管底可见白色的RNA沉淀。弃上清，加入无RNase的75%乙醇1 ml，涡旋混匀后，重复一次。弃上清，空气中干燥RNA沉淀5～10 min，将沉淀溶于20 μl DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μl用微量分光光度计测定样本的浓度和纯度。

1.5 cDNA合成 根据VAZYME公司的逆转录试剂盒的操作说明合成cDNA，逆转录反应的体系。20 μl体系中含5 μl RNA，2 μl Oligo (dT) 15 (10 μmol/L)，4 μl dNTP (2.5 mmol/L)，4 μl Hiscript Buffer，1 μl Hiscript Reverse Transcriptase，0.5 μl Ribonuclease Inhibitor和3.5 μl ddH2O。反应条件为25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min反转录反应，85 ℃ 5 min反转录酶失活反应，立即放置4 ℃冰箱。

1.6 荧光定量PCR反应 用Primer 5设计大鼠肠黏膜ORL-1及GAPDH引物：ORL-1上游引物:5′-TGGCTTCAGTGGTTGGTGTT-3′，下游引物:5′-CAGGTTTCGGTCCTTCTCCC-3′,扩增片段长245 bp；GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，扩增片段长253 bp。以cDNA为模板，按AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒说明进行进行Real-time PCR。20 μl体系中含10 μl SYBR Green Master Mix (2×)，0.4 μl PCR Forward Primer(100 μmol/L)，0.4 μl PCR Reverse Primer(100 μmol/L)，0.2 μl ROX Reference Dye 2(50×)，4 μl cDNA和5 μl ddH2O。PCR程序采用两步法，具体步骤：95 ℃预变性10 min，1个循环；95 ℃变性30 s，60 ℃退火和延伸30 s，40个循环。实验重复3次，计算均值。扩增完毕后分析熔解曲线，采用2-ΔΔCt法分析ORL-1 mRNA表达。

1.7 Western blotting分析大鼠肠黏膜ORL-1蛋白的表达情况 匀浆器中球状部位放入组织块，向匀浆器中加入400 μl单去污剂裂解液裂(含PMSF)进行匀浆，研磨操作需要在冰上，研磨多次后，冰浴30 min，将组织匀浆液转移到1.5 ml离心管，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min后，取0.5 μl上清蛋白提取液，进行BCA法蛋白定量。总蛋白变性5 min，凝胶的配置浓度为12%的SDS-PAGE，按顺序进行蛋白上样并进行电泳，电泳分离蛋白后，使用电转移槽转移至PVDF膜。在室温条件下，将膜放入装有BSA器皿封闭2 h后，PVDF膜转到置于按1∶1 000稀释的ORL-1多克隆抗体稀释液中，于4 ℃冰箱内孵育过夜。TBST充分洗膜4次，每次5 min。再置于按1∶10 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG稀释液中37 ℃孵育2 h，TBST充分洗膜4次，每次5 min。采用ECL发光液进行显影，运用 Image J 软件进行条带图像分析。

2 结果

2.1 慢性心理应激对大鼠肠黏膜ORL-1 mRNA表达的影响 对照组和实验组结肠黏膜均可检出ORL-1 mRNA的表达。实时荧光定量 PCR 得出的数据经 2-ΔΔCt法分析，结果显示：应激后1周实验组ORL-1 mRNA表达水平最高，2～4周逐渐降低，但仍明显高于应激前水平。与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 慢性心理应激对大鼠肠黏膜ORL-1的蛋白表达的影响 1周实验组ORL-1 蛋白表达水平最高，2～4周逐渐降低，但仍明显高于应激前水平，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图1)。

分组0周1周2周3周4周对照组1.000±0.1721.117±0.2071.283±0.1651.163±0.2111.156±0.233实验组1.023±0.1952.824±0.376*2.217±0.290*1.733±0.301*1.629±0.308*

注：与对照组比较 ，*P<0.05。

图1 两组不同时间点肠黏膜ORL-1蛋白表达

Fig 1 Expressions of intestinal mucosal ORL-1 protein in two groups

3 讨论

心理应激在功能性肠道疾病特别是IBS疾病中普遍认为发挥重要作用，并且心理应激会加速和加强IBS疾病的发生和发展。应激又称为应激反应，是指机体受到内外各种环境因素刺激时所出现的全身非特异性适应反应。应激最直接表现即精神紧张，随后引起广泛的神经内分泌变动并且表现为内脏敏感性增强。其中慢性束缚可长期提高脑垂体和肾上腺皮质分泌一些相关的激素，最终通过下丘脑-垂体-肾上腺轴对内脏如肠道发生作用[7]。慢性束缚是在相当长一段时间内，持续进行一定强度的刺激，使机体因为长期处于过强的应激状态下，而最终表现可为IBS。慢性束缚所产生的心理应激会直接引起机体相关的特异性变化，除此之外还会引起一系列与慢性束缚无直接关系的非特异性反应继而发生神经内分泌反应，及细胞和体液中某些蛋白质成分的改变。

分组0周1周2周3周4周对照组1.000±0.1141.042±0.2161.145±0.1751.121±0.1981.103±0.184实验组1.023±0.1412.148±0.312*1.814±0.175*1.698±0.286*1.537±0.265*

注：与对照组比较，*P<0.05。

中枢神经系统(central nervous system, CNS)与肠神经系统(enteric nervous system, ENS)之间存在密切的相互关系。内源性阿片肽主要通过其受体在中枢神经系统发挥作用，有显著镇痛功能和作用。孤啡肽及孤啡肽受体(opioid receotor-like 1 receptor,ORL1)是内源性阿片肽系统里新发现的一种成员，广泛分布于中枢神经系统及胃肠道中，并且参与对神经损伤和疼痛的调节，其对脑损伤中的具体作用及作用机理已经进行了大量的研究[8-10]，而在胃肠道中发生的作用还有待关注。OFQ/ORL-1系统在胃肠道的调节过程中并不直接作用于肠道肌细胞而是通过对肠神经系统的调节间接发挥作用[11-13]。

已有研究[14]显示：ORL-1在近端结肠较为丰富，因此本次实验在近端结肠(距回盲部2 cm)处取2块黏膜进行实验，以提高实验的准确性。发现对照组和实验组结肠黏膜均可检出ORL-1表达，充分说明OFQ/ORL-1系统在人的胃肠运动的调节中很可能有至关重要的作用。同时我们对比了正常大鼠与慢性心理应激大鼠间肠道ORL-1表达的差异。发现慢性心理应激大鼠结肠处的ORL-1表达量显著高于正常大鼠。说明不但脑肠轴神经系统受OFQ/ORL-1系统的调控，很可能脑肠轴神经对OFQ/ORL-1系统也具有一定调节作用，并表现为患者ORL-1表达量的变化。这在其他研究中也得到证实[11]。并且在1周内达到峰值，而在随后的2～4周逐渐下降，但始终高于对照组，在我们前期实验已经发现[15]：应激后1周血浆OFQ水平最高，2～4周逐渐降低，但仍明显高于应激前水平，且OFQ含量的变化与肠道敏感性的改变呈显著相关关系。结肠黏膜ORL-1的表达与血浆OFQ含量的变化趋势一致，推测，结肠黏膜ORL-1的表达变化与肠道敏感性的改变也具有相关性。同时两次实验发现慢性心理应激时肠道敏感性、血浆OFQ及肠黏膜ORL-1表达均增高，并随着应激时间延长逐渐降低，这一现象说明IBS可能与长期应激产生的适应性有关[16-17]。

综上所述，我们发现慢性心理应激引起的IBS发生机制可能与其促进大鼠肠道肠黏膜孤啡肽受体(ORL-1) mRNA及蛋白表达量上调相关。OFQ/ORL-1系统参与了由慢性心理应激引起IBS的病理演变过程，对此类胃肠病的发生发挥着一定的作用，当然，ORL-1的分布及数量在不同动物胃肠道中存在较大差异，调节机制及作用部位都有差异[18]，因此，对于人类的此项研究需进一步深入探讨，其作用机制与途径也有待于进一步深入研究。

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(责任编辑：马 军)

Effect of psychological stress on expression levels of intestinal opioid-receptor-like-1 mRNA and protein in rats models of irritable bowel syndrome

WANG Xin, JU Wei, LI Wuliang, LI Ping, LI Xin

Department of Gastroenterology, Xi’an Ninth Hospital, Xi’an 710054, China

Objective To investigate the effect of psychological stress on expression levels of opioid-receptor like-1 (ORL-1) mRNA and protein in irritable bowel syndrome (IBS) models rats.Methods Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (n=40) and model group (n=40). IBS models were established by restrain stress method. Eight rats in each group were sacrificed at 0, 1, 2, 3, 4 weeks， respectively, and a partial colon tissue close to the ileocecal region about 2 cm in length was taken; and expression level of ORL1 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and expression level of ORL1 protein was detected by Western blotting.Results Compared with the control group, the expression levels of ORL1 mRNA and protein significantly were increased in model group at 1, 2, 3 and 4 weeks (P<0.05). The expression levels of ORL1 mRNA and protein at 1 week was the highest in model group, then gradually decreased at 2～4 weeks.Conclusion The effect of psychological stress on IBS in rats is possibly related to the up-regulation of expression levels of ORL1 mRNA and protein.

Psychological stress; Irritable bowel syndrome; ORL-1; RT-PCR; Western blotting

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.009

2010年陕西省卫生厅科研基金

王鑫，硕士，主任医师兼科主任，研究方向：胃肠疾病及动力方面的研究。E-mail:252705009@qq.com

R574.4

A

1006-5709(2017)05-0514-04

2016-11-20