中国甘肃汉/回族人群C1GALT1、DEFA基因多态性与IgA肾病易感性的关系

司城静 荆 焰 杜维翠 刘 佳 薛婷文

(兰州石化总医院,兰州730060)

中国甘肃汉/回族人群C1GALT1、DEFA基因多态性与IgA肾病易感性的关系

司城静 荆 焰 杜维翠 刘 佳 薛婷文

(兰州石化总医院,兰州730060)

目的：探讨β-1,3-半乳糖基转移酶(C1GALT1)基因rs1008898位点及α防御素(α-defensin,DEFA) 基因rs2738081位点多态性与中国甘肃省汉族人群和回族人群IgA肾病易感性的关系，筛查预测IgA肾病的分子标记。方法：本研究选取甘肃地区患IgA肾病的汉族个体146例、回族个体83例作为实验组，另选取健康汉族个体180例、健康回族个体100例作为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP) 方法以及PCR产物基因测序法对单核苷酸多态性基因位点进行基因分型，采用卡方检验比较各基因型、等位基因在病例组和对照组中的分布差异，评价各基因型、等位基因与IgA肾病发病风险的关系。结果：①汉族IgA肾病患者rs1008898位点的GG基因型频率与健康对照组之间有统计学差异(OR=2.489，95CI：1.259～4.922，χ2=7.037，P=0.008)，且G等位基因可能增加患IgA肾病的风险(OR=1.268，95%CI：1.056～1.523，χ2=6.709，P=0.01)。②回族IgA肾病患者rs1008898位点的多态性与健康对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)rs2738081位点多态性在汉族、回族IgA肾病患者及其健康对照组之间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论：rs1008898位点G等位基因可能增加甘肃地区汉族人群患IgA肾病的风险。

IgA肾病；单核苷酸多态性；rs1008898；rs2738081

IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是世界范围内尤其是亚洲地区最常见的原发性肾小球肾炎，是引起终末期肾功能衰竭(End-stage renal failure,ESRF)的重要原因之一[1]。IgAN是指在肾小球系膜区及毛细血管袢以IgA 为主的免疫球蛋白沉积的肾小球疾病。其发病机制尚不明确，目前认为IgA肾病是一种复杂的疾病，是遗传因素和环境因素等共同作用的结果[2]。近年来诸多研究表明遗传因素在IgAN的发病机制中起重要作用，据多项全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)研究表明基因多态性与IgAN的易感性相关[3-7]，其中包括参与IgA1糖基化的β-1，3-半乳糖基转移酶(C1GALT1)基因[3]以及参与天然免疫的α防御素(α-defensin,DEFA)基因[4-6]。已有研究表明C1GALT1基因的rs1008898位点和位于染色体8p23区域的DEFA基因的rs2738081位点的多态性与IgAN的易感性有一定的关系[8，9]，但这种相关性仍存在一定的争议，还需进一步的研究[10]。

因此，本研究通过病例-对照研究，收集甘肃地区汉族人群及回族人群样本，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法对rs1008898及rs2738081位点进行单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)检测，以探讨中国甘肃汉族人群及回族人群中这两个位点的多态性与IgAN易感性的关系，并对以往研究结果作以验证。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究采用病例-对照研究，选择2012年3月至2016年2月在兰州石化总医院就诊的汉族个体146例、回族个体83例经肾活检病理检查诊断证实为IgAN的患者作为病例组，并选择同期在我院体检的汉族个体180例、回族个体100例健康者作为对照组。所有汉族研究对象无亲缘关系，所有回族研究对象无亲缘关系且3代内无异族通婚史。病例组汉族人群男82例，女64例，年龄(37.88±8.42) 岁；回族人群男39例，女44例，年龄(35.55±7.61)岁。对照组汉族人群男100例，女80例，年龄(38.24±8.65)岁；回族人群男50例，女50例，年龄(35.17±9.07) 岁。所有研究对象在采集标本前均已签署知情同意书。此研究已通过兰州石化总医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 用EDTA抗凝管收集受试者的静脉血2 ml，血液样本置于-20℃保存。采用血液基因组柱式提取试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，按照试剂盒说明书提取血液中的基因组DNA。DNA样本于-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 rs1008898和rs2738081两个位点的相应引物由上海英潍捷基生物公司合成，PCR过程所用2×Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司，PCR仪为德国EasyCycler96 PCR仪。具体实验过程如下： rs1008898的上游引物序列为：5′-ATTGTTTAAGAAGAAGATG-3′，下游序列为：5′-GTATTTAGCTATTATCTATGAG-3′，扩增目的序列长度为377 bp，PCR扩增体系总体积为25 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，2×Taq Master Mix 12 μl，双蒸水11 μl。PCR反应条件：预变性94℃2 min，94℃变性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环，最后72℃延伸7 min。扩增产物经2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后保存于-20℃。

rs2738081的上游引物序列为：5′-TCTACCTTCCTGAGCCTG-3′，下游序列为：5′-TTCTATCCCAGTCAAACTCC-3′，扩增目的序列长度为384 bp，PCR扩增体系总体积为25 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，2×Taq Master Mix 12 μl，双蒸水11 μl。PCR反应条件：预变性94℃ 2 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环，最后72℃延伸7 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后保存于-20℃。

1.2.3 限制性片段长度多态性分析 针对rs1008898和rs2738081两个位点的酶切反应所使用的限制性内切酶分别为HpyAV和BanⅡ。酶切反应总体系包含：PCR反应产物4 μl、限制性核酸内切酶0.2 μl、反应缓冲液1 μl、超纯去离子水4.8 μl，并于37℃进行酶切反应，反应时间分别为18 min和60 min。酶切产物经2.5 %琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 测序验证分型结果 选取部分PCR产物样本由北京擎科新业生物技术有限公司进行测序以验证PCR-RFLP结果。

1.3 统计学处理 利用在线软件(https://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl)进行Hardy-Weinberg平衡检验，检验水准为0.05。用SPSS19.0软件进行统计学分析，经χ2检验分析两组间的基因型和等位基因频率的分布差异，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C1GALT1基因位点rs1008898和DEFA基因位点rs2738081的基因分型 rs1008898位点经PCR-RFLP分型后，若只有377 bp一个条带，即为TT基因型；若存在99和278 bp两个条带，即为GG基因型；若存在377、278和99 bp三条条带，即为GT基因型。rs2738081位点经PCR-RFLP分型后，若只有384 bp一个条带，即为AA基因型；若存在147和237 bp两个条带，即为CC基因型；若存在384、237和147 bp三条条带，即为AC基因型(图1)。此外，通过基因测序证实了PCR-RFLP分型结果(图2)。

2.2 两位点基因型及等位基因频率在两组人群中的分布 病例组和对照组的汉族和回族人群的rs1008898、rs2738081位点各等位基因频率分布均符合遗传学Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，说明本研究所选择人群具有代表性，见表1。

rs1008898位点的三种基因型GG、GT、TT在汉族人群的IgAN病例组中的分布频率为36.99%、50.68%和12.33%；G和T等位基因频率分别为62.33%和37.67%。在汉族人群对照组中，GG、GT、TT基因型频率分别为26.11%、52.22%和21.67%；G和T等位基因频率分别为52.22%和47.78%。rs1008898位点的基因型频率和等位基因频率在汉族病例组与对照组之间有统计学差异(χ2=7.037，P=0.008和χ2=6.709，P=0.01)。卡方检验结果显示：rs1008898位点G等位基因可能增加患IgAN的风险(OR=1.268，95%CI：1.056～1.523),见表2。

图1 PCR产物酶切片段琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 DNA ladder maps of PCR-RFLPNote: A.rs1008898;B.rs2738081.

在回族人群中，IgAN病例组rs1008898位点GG、GT、TT基因型频率分别为33.73%、39.76%和26.51%；G和T等位基因频率分别为53.61%和46.39%。对照组中GG、GT、TT基因型频率分别为29.00%、44.00%和27.00%；G和T等位基因频率分别为51.00%和49.00%。rs1008898位点的基因型频率和等位基因频率在回族人群病例组与对照组之间无统计学差异(χ2=0.519，P=0.471和χ2=0.248，P=0.618)。rs2738081位点的基因型频率和等位基因频率在汉族和回族的IgAN病例组和对照组的分布差异无统计学意义，见表2。

图2 PCR产物测序图Fig.2 Gene sequencing results of rs1008898Note: A.Gene sequencing results of rs1008898；B.PCR products.

表1 甘肃汉族与回族人群rs1008898、rs2738081基因型和等位基因频率的分布比较及H-W平衡检验

Tab.1 Genotype and allele frequencies of rs1008898 and rs2738081 in normal controls and IgAN patients in Han and Hui population and test of Hardy-Weinberg equilibrium

RacesGroupsnSNPGenotypefrequencies(%)GG(CC)GT(CA)TT(AA)Allelefrequency(%)G(C)T(A)PHWEHanCase146rs100889854(36.99)74(50.68)18(12.33)182(62.33)110(37.67)0.34rs2738081105(71.92)34(23.29)7(4.79)244(83.56)48(16.44)0.07Control180rs100889847(26.11)94(52.22)39(21.67)188(52.22)172(47.78)0.53rs2738081119(66.11)50(27.78)11(6.11)288(80.00)72(20.00)0.08HuiCase83rs100889828(33.73)33(39.76)22(26.51)89(53.61)77(46.39)0.07rs273808154(65.06)27(32.53)2(2.41)135(81.33)31(18.67)0.52Control100rs100889829(29.00)44(44.00)27(27.00)102(51.00)98(49.00)0.23rs273808168(68.00)30(30.00)2(2.00)166(83.00)34(17.00)0.53

Note：PHWE.Pvalue of the Hardy-Weinberg equilibrium test.

表2 rs1008898、rs2738081为点多态性与汉族、回族IgA肾病易感性的关系

Tab.2 Relationship between polymorphisms and suscepti-bility to IgAN in Han and Hui population

RacesSNPGenotype/AlleleCasegroupControlgroupPHanrs1008898GenotypeGG5447GT7494TT18390.008AlleleG182188T1101720.01rs2738081GenotypeCC105119CA3450AA7110.315AlleleC244288A48720.243Huirs1008898GenotypeGG2829GT3344TT22270.471AlleleG89102T77980.618rs2738081GenotypeCC5468CA2730AA220.697AlleleC135166A31340.676

3 讨论

近年来，多项研究发现与中国汉族人群IgAN相关的易感基因，包括TNFSF13、MYH9、MHC、GATSL3、C1GALT1、DEFA等[4-6,10-13]。其中C1GAL-T1基因编码的β-1，3-半乳糖基转移酶(C1GALT1)参与IgA1分子铰链区的糖基化过程，而C1GALT1活性降低则可引起IgA1分子糖基化异常，异常糖基化的IgA1分子沉积于肾小球系膜区是IgA1造成肾小球损伤的致病方式之一[14,15]。另外，IgAN典型的临床特点是上呼吸道黏膜感染后立即出现肉眼血尿，提示天然免疫参与了IgAN的发病[16]。而DEFA基因编码的α防御素是一种宿主防御肽，参与免疫调节，在天然免疫中发挥着重要的作用[9]。

Pirulli等[17]发现在意大利人群C1GALT1基因rs1047763位点多态性与IgAN易感性相关，而rs1008898位点多态性与IgAN易感性无关。在Li等[10]的研究中，rs1008898位点多态性与北京人群的IgAN易感性也呈不相关。但同样是对于意大利人群的研究，Bertinetto等[8]认为C1GALT1基因rs1008898位点多态性与IgAN易感性具有相关性，并且认为该位点的G等位基因会增加IgAN的患病风险。本研究结果显示，rs1008898位点多态性与甘肃地区回族人群的IgAN易感性无关；而与甘肃地区汉族人群的IgAN易感性相关，且该位点的G等位基因会增加IgAN的患病风险，与Bertinetto等[8]研究结果一致。另外，在本研究中我们还探讨了DEFA基因rs2738081位点多态性与IgAN易感性的关系。结果发现在甘肃汉族和回族人群各自的病例-对照组之间该位点的基因型、等位基因频率差异均无统计学意义。而在Xu等[9]的研究中发现rs2738081位点多态性与中国南方汉族人群的IgAN易感性相关。这些针对相同位点不同人群的研究并没有一个统一的结论，造成这种现象的原因可能是基因多态性受不同的环境因素和遗传因素的影响，也有可能与受试样本量之间的差异有关。

总之，本次研究分析了C1GALT1基因rs1008898位点以及DEFA基因rs2738081位点多态性与甘肃地区汉族和回族人群中IgAN的关系，发现C1GALT1基因rs1008898位点与甘肃汉族人群IgAN发病呈明显相关，但并未发现与甘肃回族人群IgAN发病的相关性；而DEFA基因rs2738081位点与甘肃地区汉族和回族人群IgAN发病的相关性也都未发现到。该研究结果为探讨IgAN的易感因素，同时为IgAN发生发展的分子遗传机制提供了一定的数据基础。

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[收稿2016-10-20 修回2016-11-20]

(编辑 许四平)

Association between C1GALT1，DEFA polymorphisms and its susceptibility to IgA nephropathy in Chinese Han and Hui population in Gansu Province

SICHENGJing，JINGYan，DUWei-Cui，LIUJia，XUETing-Wen.

PetrochemicalGeneralHospitalofLanzhou,Lanzhou730060,China

Objective:To investigate the association between the C1GALT1 rs1008898，the DEFA rs2738081 polymorphisms and susceptibility to IgA nephropathy in Chinese Han and Hui population in area of Gansu Province and explore molecular markers to predict IgA nephropathy.Methods: In this study,there were 146 patients with IgAN and 180 normal controls in Han people and 83 patients with IgAN and 100 normal controls in Hui people.Two SNPs as rs1008898 and rs2738081 were analyzed with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and polymerase chain reaction-gene sequencing technology.The genotype and allele frequency of rs1008898 and rs2738081 were compared between patients with IgAN and normal controls.Results: Rs1008898 GG genotypes and G allele were over represented in IgAN patients compared with controls.Distribution of rs1008898 polymorphism in patients with IgAN and normal controls showed no difference in Hui people.Neither Han nor Hui population,rs2738081 polymorphism had difference between IgAN patients and normal controls.Conclusion: The G allele of rs1008898 probably has correlation with the genetic susceptibility of IgAN in Gansu Han people.

IgA nephropathy;Single nucleotide polymorphisms;rs1008898;rs2738081

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.023

司城静(1979年-)，女，主治医师，主要从事对各种原发性和继发性肾小球疾病治疗和研究、急慢性肾衰诊断及血液透析治疗，E-mail:scjsgs2sw@126.com。

R392.11

A

1000-484X(2017)05-0746-05