中药宽体金钱蛭抗凝血有效部位的提取工艺研究

栾淑华刘 君*

（1 沈阳市化工学校，辽宁 沈阳 110122；2 辽宁省中医药研究院临床药理实验室，辽宁 沈阳 110034）

中药宽体金钱蛭抗凝血有效部位的提取工艺研究

栾淑华1刘 君2*

（1 沈阳市化工学校，辽宁 沈阳 110122；2 辽宁省中医药研究院临床药理实验室，辽宁 沈阳 110034）

目的 研究中药宽体金钱蛭抗凝血有效部位的提取工艺。方法 分别采用不同浓度的乙醇、正己烷、正丁醇、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液、不同浓度乙醇等溶剂提取宽体金钱蛭，以家兔全血凝固的时间为指标，比较了几种提取液对凝血时间的影响；采用正交试验优化了提取工艺。结果 几种提取液中，生理盐水的抗凝时间最长；正交试验结果表明，提取次数为显著性影响因素。结论 根据实际情况，将宽体金钱蛭的提取工艺确定为加生理盐水提取2次，第1次加5倍量，提取2 h，第2次加3倍量，提取2 h。

水蛭；宽体金钱蛭；提取工艺；抗凝血；有效部位

宽体金钱蛭Whhmania pigra Whitman，又称蚂蟥，为中药水蛭的药用品种之一。中国药典项下水蛭有三个品种，分别为水蛭科动物宽体金钱蛭（蚂蟥）Whhmania pigra Whitman、水蛭（日本医蛭）Hirudo nipponica Whitman、柳叶蚂蟥（尖细金钱蛭）Whhmania acranulata Whitman的干燥全体。具有破血痛经，逐瘀消癥之功效[1]。现代研究表明，水蛭中主要含有蛋白质、多肽、氨基酸等成分，具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤等作用[2]。水蛭Hirudo nipponica Whitman中主要的抗凝血成分为水蛭素，是一种含有65个氨基酸残基的多肽，相对分子质量为7000左右[2]，水蛭素被认为是目前发现的作用最强的凝血酶抑制剂，作用强于肝素。目前对水蛭（日本医蛭）Hirudo nipponica Whitman这个品种的研究较多，但对宽体金钱蛭这个品种化学成分及相关的研究报导较少，而宽体金钱蛭为中药水蛭药用的主流品种，在临床上应用较广[3]。另有研究指出，水蛭与宽体金钱蛭2个品种的动物的食性不同，因而受其影响，二者所含的有效成分不同。医用水蛭类主要是靠吸吮动物的血液为生，所以水蛭素主要是存在于其口部的唾液中，但宽体金钱蛭的食性医用水蛭类不同，不是靠吸血为生，而是以捕食水中的小动物及吸吮螺体、蚌壳的体液为生[4]，故而很多人认为在宽体金钱蛭中不含有水蛭素，而目前也确实没有从宽体金钱蛭中提出水蛭素的报导。现代药理研究表明，宽体金钱蛭也具有抗凝血、抗血栓及抗血小板聚集等作用[2]。本研究以宽体金钱蛭作为研究对象，探讨其抗凝血有效部位的最佳提取工艺。

1 材 料

1.1 药材：宽体金钱蛭新鲜药材购于徐州，经辽宁中医药大学陈焕亮教授鉴定为宽体金钱蛭（Whitmania pigra Whitman）。

1.2 仪器与试剂：恒温玻璃水浴（扬州盛凯化工设备有限公司）；（牛）血清白蛋白、凝血酶试剂（由中国食品药品检定研究院提供）；（牛）纤维蛋白原（上海谷研实业有限公司）；pHS-25型酸度计（上海光学仪器厂）；试剂均为分析纯。

1.3 动物：中国白兔，由沈阳医学院实验动物中心提供。

2 方 法

2.1 不同提取物抗凝活性比较

2.1.1 不同提取液的制备：取宽体金钱蛭干品药材，粉碎过三号筛。取适量用5倍量正己烷溶液冷浸过夜，离心（4000转/分），取上清液，沉淀部分再用3倍量的正己烷溶液冷浸过夜，离心（4000转/分），取上清液，合并二次的上清液，备用（Ⅰ）。同法制备正丁醇提取液（Ⅱ）、蒸馏水提取液（Ⅲ）、0.02 moL/L（pH=6.8）的磷酸盐缓冲液提取液（Ⅳ）和生理盐水提取液（Ⅴ）、30%乙醇提取液 （Ⅵ）、50%乙醇提取液（Ⅶ）、75%乙醇提取液（Ⅷ）、95%的乙醇提取液（Ⅸ）。将提取液分别浓缩成1 mL相当于含宽体金钱蛭药材1 g。

2.1.2 不同提取液抗凝活性筛选：以家兔全血凝固时间作为考察指标，分别考察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ提取液对凝血时间的影响。

取家兔，从颈总动脉插管采血，采用试管法，设实验组和对照组，对照组采用生理盐水，取试管40支，先分别加入以上的各种提取溶液及生理盐水各0.1 mL，每组4支，再每管加入新鲜手兔血0.9 mL，立即开始计时，置（37±0.5）℃恒温水浴中，每隔15 s倾斜1次，观察血液是否凝固，至血液成为冻胶状不再流动为止，记录各管的凝固时间。经方差分析确定的提取溶媒。

2.2 宽体金钱蛭的提取工艺考察：分别以加溶媒量、提取时间、提取次数作为考察因素，进行三因素三水平（L934）正交试验。经不同提取液抗凝活性筛选，确定生理盐水为最佳的提取溶媒。 取宽体金钱蛭新鲜药材，加生理盐水（N.S.）适量，匀浆后，分成9份。按以下提取方法进行试验。见表1。

表1 工艺考察因素水平表

考察指标：①采用福林酚法（lowry法），测定每份提取液的蛋白质含量。②按凝血酶滴定法，测定每份提取液的抗凝血酶活性。

评分标准：规定蛋白含量的满分为40分，抗凝血酶活性的满分为60分，所测得的蛋白质最高含量为每克药材含蛋白质32.04 mg，定为40分，其他值计分方法：蛋白含量/32.04×40；抗凝血酶活性最高含量为12，定为60分，其他值计分方法：效价/12×60，二项指标总和满分为100分。

2.3 蛋白质含量测定：采用福林酚法（lowry法）测定蛋白质含量，溶液配制方法及试验方法参照中国药典2015年版四部，通则0731，第二法，方法一。

2.4 抗凝血酶活性测定：采用凝血酶滴定法，试验方法参照中国药典2015年版一部[5]。

3 结 果

3.1 不同提取液对家兔全血凝固时间的影响：结果见表2。

表2 各提取液对家兔全血凝固时间的影响（）

表2 各提取液对家兔全血凝固时间的影响（）

组别结果(s)凝血时间(d)P空白组195 182 177 165179.75±12.42Ⅰ465 378 490 415437.00±50.19**P＜0.01Ⅱ320 265 234 212257.75±46.85*P＜0.05Ⅲ455 462 420 480454.25±25.14**P＜0.01Ⅳ420 457 413 498447.00±39.10**P＜0.01Ⅴ705 764 698 744727.75±31.52**P＜0.01Ⅵ296 354 312 305316.75±25.68*P＜0.05Ⅶ387 435 322 349373.25±49.05**P＜0.01Ⅷ560 479 531 510520.00±34.17**P＜0.01Ⅸ356 412 389 365380.50±25.20**P＜0.01

各组测定结果与对照组比较，差异均显著（P＜0.05，0.01），其中生理盐水组（N.S.）的血液凝固时间最长，故采用生理盐水（N.S.）作为提取溶媒。

3.2 提取工艺正交试验考察结果：见表3。

表3 正交试验及结果

3.3 对结果进行方差分析，见表4。

表4 方差分析[F（2,2）=19.0]

3.4 结论：根据正交试验结果，影响宽体金钱蛭鲜品提取工艺因素顺序为：提取次数＞加水量＞提取时间，提取次数为主要影响因素，提取时间及加水量为次要影响因素。综合考虑，提取工艺确定为采用N.S.提取二次，第1次加5倍量，提取2 h，第2次加3倍量，提取1 h。

4 讨 论

4.1 宽体金钱蛭药材的加工方法为新鲜药材捕捉后洗净，用沸水汤死，晒干或低温干燥。现代有研究表明，高温易使其中的蛋白质及肽类成分被破坏，但中医临床一般是采用其干品药材或滑石粉炮制品，依然认为其疗效甚佳，故在干品药材及炮制品中也应存在抗凝血的活性物质。本试验以其干品药材为研究对象，探讨其抗凝血的有效部位。

4.2 水蛭的抗凝酶活性因其食性的不同而有差异，宽体金钱蛭作为非吸血类的水蛭，其抗凝血酶活性与吸血的水蛭类如日本医蛭相比有较大的差异[6]，故采用凝血酶活力滴定法测定宽体金钱蛭的抗凝活性较低，而且可能误差较大，所以在工艺考察过程中，采用蛋白质含量与抗凝血酶活性双重的考察指标对不同工艺提取液进行考察。

[1] 张岚.水蛭的提取工艺研究[J].黑龙江医药,2014,25(1):80-81.

[2] 王蒙萌.水蛭的化学成分及药理作用[J].黑龙江中医药,2008, 36(2):47-48.

[3] 瞿新燕.水蛭的抗凝血作用研究[J].现代中西医结合杂志,2013, 19(13):1582-1583.

[4] 梁进权.水蛭抗凝抗血栓活性及其与品种、提取方法的关系[J].中西医结合心脑血管病杂志,2009,7(9):1096-1097.

[5] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社, 2015:83-84.

[6] 张彬,汪波,龚元,等.几种水蛭抗凝血物质提取及活性分析[J].中山大学学报(自然科学版),2012,51(4):92-96.

R282.710.5

B

1671-8194（2017）10-0037-03

辽宁省教育厅课题项目（2006B058）

*通讯作者